喉鳞癌组织中PTTG VEGF-C的表达及与临床病理特征的相关性

高立生, 高 珊, 徐 勤, 刘 双, 刘晓东

(1.承德护理职业学院外科教研室, 河北 承德 0670002.承德医学院附属医院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

喉鳞癌组织中PTTG VEGF-C的表达及与临床病理特征的相关性

高立生1, 高 珊2, 徐 勤2, 刘 双2, 刘晓东2

(1.承德护理职业学院外科教研室, 河北 承德 0670002.承德医学院附属医院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

目的：探讨喉鳞癌组织中垂体肿瘤转化基因(PTTG)及血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的表达及其与喉癌病理特征的关系。方法:应用免疫组化SP法分别检测60例喉癌病理组织和32例癌旁正常组织中PTTG和VEGF-C的表达水平，并应用RT-PCR法检测以上组织中PTTG mRNA和VEGF-C mRNA的表达水平。结果:喉鳞癌病理组织中PTTG和VEGF-C表达情况均显著高于相应癌旁正常组织(P<0.01)；PTTG和VEGF-C的表达在淋巴结有否转移组、临床不同分期组与不同分化程度的喉鳞癌组组间比较，均有统计学意义(P<0.01)。结论:喉鳞癌的发生、发展、侵袭与转移的过程中PTTG和VEGF-C起了重要作用，PTTG与VEGF-C的联合检测，可能对喉癌的预后判断产生重要意义。

喉鳞癌; PTTG; VEGF-C

喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发病机制非常复杂。影响喉鳞癌预后的主要因素包括癌细胞是否呈侵袭性生长及淋巴结是否有转移。垂体肿瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene，PTTG)能够使正常细胞转化成肿瘤细胞，进而导致恶性肿瘤的发生。微淋巴管系统在肿瘤细胞向周围组织浸润和向远处转移的过程中发挥着重要作用。血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)，是可以刺激淋巴管内皮生长的因子，是具有反式激活作用的PTTG蛋白的靶基因之一，VEGF-C可能通过作为PTTG介导微淋巴管生成行为的效应剂来发挥作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取我院耳鼻喉科2007年8月至2013年8月期间收治的60例原发性喉鳞癌患者，以上患者均接受喉癌手术治疗，其中男50例，女10例；年龄≥60岁32例，<60岁28例；吸烟组48例，均为吸烟史20年以上(每日>20支)，对照组12例；以上患者术前均未接受放、化疗。通过喉癌手术切除获60例肿瘤组织标本，并收集32例相应癌旁组织标本。所有标本均经过两名有诊断经验病理医师明确诊断。其中23例有淋巴结转移，37例无淋巴结转移；22例中低分化，38例高分化；26例声门型，34例声门上型；肿瘤直径<3cm者36例，肿瘤直径≥3cm者24例；TNMⅠ、Ⅱ期共42例，TNMⅢ、Ⅳ期共18例。PTTG、VEGF-C兔抗人多克隆抗体购自福建迈新公司;RT-PCR检测试剂分别购自Invitrogen公司与上海生工生物工程技术服务有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法：取0.1g标本组织于液氮中冻存，以用于提取mRNA，4%中性福尔马林固定其余组织，常规脱水石蜡包埋，以用于免疫组化染色。①取石蜡包埋的标本，作2张石蜡切片，其中一张给予VEGF-C免疫组化染色，另一张给予PTTG免疫组化染色；②室温孵育，抗原修复，PBS冲洗；③胎牛血清封闭，滴加一抗50μL 4℃过夜，PBS冲洗；④加二抗，PBS冲洗；⑤DAB显色，复染，脱水，封片，镜检。

1.2.2 RT-PCR检测：采用半定量PCR技术，运用Trizol试剂采用一步法提取总RNA，用AMV逆转录酶将其反转录成cDNA，β-actin作为内参照基因,扩增片段为145bp。PCR产物经电泳后，每例PTTG、VEGF-C与相应β-actin扩增产物条带累积光密度(IOD)的比值作为PTTG、VEGF-C mRNA的相对表达量。①PTTG基因上游引物(5'to 3')：TGA TCC TTG ACG AGG GAG；下游引物(5'to 3')：GGT GGC AAT TCA ACA TCC AGG;② VEGF-C基因上游引物(5'to 3')：CTC TCT CAA GGC CCC AAA TCC；下游引物(5'to 3')：TCT TGT TCG CTG CCT GAC ACT 。

1.3 判定标准:PTTG、VEGF-C蛋白主要在细胞质内进行表达，阳性反应以出现棕黄色颗粒为标准。阳性对照是已知该癌阳性组织切片，PBS代替一抗作为阴性对照，采用双评分法综合判定。选取8个染色均匀肿瘤区的高倍镜视野，①按染色阳性细胞百分率(A值)评分：>50%赋值3分，25%～50%赋值2分，<25%赋值1分，阴性赋值0分。②按染色强度(B值)评分：棕褐色赋值3分，棕黄色赋值2分，浅棕黄色赋值1分，不着色赋值0分，；综合A值与B值判断结果：阳性：1～6分，阴性：0分。

1.4 统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料采用率的方式计数，χ2检验，计量资料应用均数加标准差记录，采用t检验，以a=0.05为检验水准，P<0.01，有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTTG、VEGF-C在喉鳞癌病理组织与癌旁正常组织中的表达:PTTG在喉鳞癌病理组织表达的阳性率为81.7%，在癌旁正常组织表达的阳性率31.3%，(P<0.01)；VEGF-C在喉鳞癌病理组织表达的阳性率为76.7%，在癌旁正常组织表达的阳性率为15.7%，PTTG与VEGF-C在喉鳞癌病理组织的表达均高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(P均<0.01)，见表1。

表1 PTTG VEGF-C在喉鳞癌病理组织与癌旁正常组织中的表达比较

表2 PTTG、VEGF-C在喉鳞癌病理组织中的表达及与临床实际病理因素的关系

2.2 PTTG、VEGF-C在喉鳞癌病理组织中的表达及与临床实际病理因素的关系PTTG、VEGF-C在喉鳞癌病理组织中的表达与不同临床分期、不同分化程度、有否淋巴结转移方面均有关，差异均有统计学意义(P均<0.01)；与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小及不同临床分型方面均无关，差异均无统计学意义(P均>0.01)。见表2。

2.3 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鳞癌病理组织与癌旁正常组织中的表达PTTG mRNA与VEGF-C mRNA在喉鳞癌病理组织的表达均高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义 (P均<0.01)，见表3。

表3 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鳞癌病理组织与癌旁正常组织表达

表4 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA水平在喉鳞癌组织中的表达及其临床病理因素关系

2.4 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鳞癌病理组织中的表达及与临床实际病理因素的关系(见表4)，在喉鳞癌组织中，PTTG mRNA、VEGF-CmRNA的表达与不同临床分期、不同分化程度、有否淋巴结转移方面均有关，差异均有统计学意义(P均<0.01)；与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小及不同临床分型方面均无关，差异均无统计学意义(P均>0.01)。

3 讨 论

PTTG是一种新型原癌基因，由Pei于1997年分离出[1]。有研究发现[2,3]，PTTG可通过促进细胞增殖、转化，扰乱染色体稳定性，诱导p53的细胞凋亡等作用导致肿瘤的发生。还可通过反式激活作用激活原癌基因、生长因子等途径导致肿瘤侵袭及转移[4]。近年研究发现，VEGF-C家族与肿瘤新生淋巴管形成有密切关系，是具有反式激活作用的PTTG蛋白的靶基因之一，能够特异性地诱导淋巴管的增生，赋予VEGF-C在恶性肿瘤的生长、浸润、侵袭及转移过程中极为重要的角色[5]。此外，VEGF-C通过诱导血管新生，增加其通透性，加剧了恶性肿瘤细胞的淋巴道转移[6]。

本研究发现：通过蛋白水平与基因水平双重比较，PTTG、VEGF-C在喉鳞癌组织中的表达均明显高于癌旁正常组织，且与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移及临床分期有关，提示PTTG、VEGF-C在喉鳞癌的发生、发展、侵袭和转移中起到了重要作用。说明PTTG、VEGF-C可能通过以上某种途径促进了喉鳞癌的进展。也有研究表明，PTTG可以上调DNA结合抑制蛋白-3(ID3)的表达，而VEGF‐C介导血管生成的介质之一也是ID3，其在恶性肿瘤细胞的生长与转移方面起到了促进作用[7]。由此可见：PTTG可能通过以上途径，促进了VEGF-C的表达，从而二者共同促进了喉鳞癌的发生及转移。

我们所做的实验研究分别从蛋白水平及mRNA水平检测了PTTG、VEGF-C在喉鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达，并在此基础上研究了二者与喉鳞癌临床病理因素之间的关系，两种水平的研究结论一致。提示在转录之前，PTTG与VEGF-C在喉鳞癌组织与癌旁正常组织中的差异性表达可能就已存在，对喉鳞状细胞癌的发生发展侵袭与转移有着重要影响。

总之，PTTG与VEGF-C在喉鳞癌发生、侵袭和转移过程中起到了至关重要的作用，如果能够发现某种途径可以抑制PTTG、VEGF-C的过度表达，则很有可能为喉鳞癌的治疗提供新的靶点。

[1] Pei L,Melmed S.Isolation and characterization of a pituitary tumortransforming gene(PTTG)[J].moL Endocrinol,1997,11(4):433～441.

[2] Kim D,Pemberton H,Stratford AL,et al.Pituitary tumor transforming gene(PTTG) inducegenetic instability in thyroid cell[J].Oncogene,2005,24(30):4861～4867.

[3] McCabe CJ,Boelaert K,Tannahill LA,et al.Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/Flk-1,and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumrs[J].Clin Endocrinology Metab,2002,87:4238～4244.

[4] Yin H,Fujimoto N,Maruyuma S.Strain differerce in regulation of pituitary tumor transforming gene(PTTG)in estrogen-induced pituitary tumor genesis in rats[J].JapaneseJournal of Cancer Research,2001,92:1034～1040.

[5] Mei J,Huang X,Zhang P.Securin is not required for cellular viability,but is required for nomal growth of mouse embryonic fibroblasts[J].C-urrent Biology,2001,11:1197～1201.

[6] Latham AM, moLina-Paris C, Homer-Vanniasinkam S, et al. An integrative model for vascular endothelial growth factor A as a tumour biomarker[J].Integr Biol(Camb),2010,2 (9):397～407.

[7] Akino K ，Akita S ，Mizuguchi T ，et al．A novel moLeeularmarker of pituitary tumor transforming gene involves in a ratliver regeneration[J].Surg Res,2005,129(1) :142～146．

Expression of PTTG and VEGF-C in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma and its Correlation with Clinicopathological Features

GaoLisheng,etal

(ChengdeNursingVocationalCollege,HebeiChengde06700,China)

Objective:To investigate the expression of PTTG and VEGF-C in laryngeal squamous cell carcinoma and the relationship with the pathological features. Methods: Immunohistochemistry and RT-PCR were adopted to detect the expression of PTTG and VEGF-C in 60 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 32 cases of para-carcinoma tissue. Results: The expression of PTTG and VEGF-C in laryngeal squamous cell carcinoma were significantly higher than that in para-carcinoma tissue (P<0.01). In laryngeal squamous cell carcinoma, the expressions of PTTG and VEGF-C were associated with differentiation, Lymph node metastasis and clinical stage (P<0.01). Conclusion: PTTG and VEGF-C might play an important role in the development of laryngeal squamous cell carcinoma. PTTG and VEGF-C might be prognostic factor of lymph node metastasis.

Laryngeal squamous cell carcinoma; PTTG; VEGF-C

1006-6233(2017)04-0656-04

河北省科技计划项目，(编号：152777218)

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.04.036