16种转基因大豆品系的实时荧光PCR法筛查

钱云开，高 飞，王海洋，崔宗岩，吴 曦，肖艳霞

(秦皇岛出入境检验检疫局，河北 秦皇岛 066004)

检测分析

16种转基因大豆品系的实时荧光PCR法筛查

钱云开，高 飞，王海洋，崔宗岩，吴 曦，肖艳霞

(秦皇岛出入境检验检疫局，河北 秦皇岛 066004)

采用实时荧光PCR法，对河北主要进口转基因大豆口岸秦皇岛港及京唐港的45批次转基因大豆进行了16种转基因大豆品系筛查。结果发现，在45批样品中均检测到GTS-40-3-2品系；30批样品检测到MON89788品系，占所检测样品66.7%；14批样品检测到A2704-12品系，占所检测样品31.1%；2批样品检测到MON87701品系，占所检测样品4.4%；1批样品检测到MON87701×MON89788品系，占所检测样品2.2%；其他品系在所有45批样品中均未检测到。通过对河北主要进口口岸转基因大豆品系方面摸底筛查，为我国转基因大豆品系进口管控提供了数据支持。

转基因大豆；实时荧光PCR；进口；品系

大豆是我国大宗进口农产品，自1997年我国开始转基因大豆进口以来，历年进口量呈现增长态势[1]。海关统计数据表明，2012—2015年我国进口大豆分别为5 838、6 338、7 140万t和8 100 万t。进口的大豆几乎全部为转基因大豆，大量的进口大豆对我国的非转基因大豆生产造成巨大冲击[2]。全球转基因大豆种植面积最大的国家为美国、巴西和阿根廷，这三国在2013年的转基因大豆种植面积占世界转基因大豆种植面积的91.5%[3]，相应的我国大豆进口来源国比较集中，也主要为美国、巴西和阿根廷[4]。

同时，近年来转基因食品社会关注度高[5]，食品安全和环境风险污染不确定，需要对转基因产品密切关注，加强筛选普查[6]。目前，由美国和欧盟公布的信息来看，世界范围内已批准商业化种植的转基因大豆品系已超过16种，而截至2016年2月，我国仅批准进口大豆品系9种。

现在，我国各出入境检验检疫机构实验室对进口转基因大豆中转基因成分的检测主要依据SN/T 1195—2003《大豆中转基因成分的定性PCR检测方法》，以及GB/T 19495.5—2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》。由于标准制定较早，这2个标准中只涉及了大豆品系“GTS-40-3-2”的检测方法。最近几年农业部、国家质检总局公布了几个品系的转基因检测方法，但由于受仪器条件及检测方法所限还没有获得普遍的推广。目前欧美国家主要采用实时荧光PCR法对转基因品系进行检测。

进口口岸检测是转基因大豆进入国内的第一道关，口岸的检测数据分析是掌握转基因大豆信息的关键环节。河北主要港口秦皇岛港和京唐港长期进口转基因大豆。我实验室收集了2012年9月至2014年7月间40船次45批转基因大豆样品及相应的标准物质，整理了成套的转基因大豆品系实时荧光PCR检测方法开展筛查检测。检测的结果为监管部门提供参考，也为制定适当的检验政策措施提供技术依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标准品与检测样品

实验室收集了可应用于大豆转基因品系检测的13种转基因大豆标准物质及对于杂交品系采用的单品系混合标准物质，具体见表1。转基因大豆品系标准分别购自欧盟联合研究中心、美国油脂化学协会(AOCS) 以及农业部转基因检测中心。

在此次实验中，实验室共收集了2012年9月至2014年7月期间40船次共45批转基因大豆样品。其中美国样品25批，阿根廷样品9批，巴西样品7批，乌拉圭样品3批，加拿大样品1批。

1.1.2 试剂与仪器

CTAB、EDTA、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙酸钠、乙醇、Tris饱和酚，Solarbio公司；CTAB提取液：55 mmol/L CTAB，1 400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10% 盐酸调pH至8.0，121℃高压灭菌20 min，备用；CTAB沉淀液：13.75 mmol/L CTAB，40 mmol/L NaCl，121℃高压灭菌20 min，备用；TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；Tris饱和酚抽提液：Tris饱和酚-三氯甲烷-异戊醇(体积比25∶24∶1)。引物探针序列见表2。

PCR System7900基因扩增仪，美国ABI；研磨机 MM301，德国 Retsch；PCR试剂盒，美国ABI。

表1 大豆品系标准物质

1.2 实验方法

1.2.1 抽样与制样

依据SN/T 1194—2003《植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法》将所收集的45批次样品通过分点采样然后缩分为5 kg小样得到。将大豆样品在研磨机中均匀粉碎，称取粉状样品。

1.2.2 样品DNA的提取

称取100 mg的转基因大豆粉末于2 mL的离心管中，加入500 μL CTAB提取液混匀，65℃水浴加热60 min。加入500 μL Tris饱和酚抽提液，混匀，离心取上清加到1.5 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温孵育60 min。12 000g离心5 min 弃上清，先加入1.2 mol/L氯化钠水溶液350 μL摇匀溶解沉淀，再加入350 μL氯仿摇匀。离心取上清至1.5 mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇摇匀静置30 min。离心弃上清，加入1 000 μL的70%乙醇洗涤2次，离心静置晾干，溶于100 μL灭菌去离子水中。

1.2.3 PCR反应体系

实时荧光PCR 反应体系为25 μL，包括12.5 μL 2×real time PCR Buffer，正向引物、反向引物各1 μL(终浓度为0.2 μmol/L)，探针1 μL (终浓度为0.2 μmol/L)，提取的样品DNA 模板2 μL，纯水10 μL[7]。

PCR反应程序为：50℃，2 min；95℃，10 min； 95℃，15 s，60℃，1 min循环40 次。

1.2.4 杂交品系的检测

杂交品系的检测为对父本和母本单品系的引物探针分别检测，共同的阳性样品进行复检。选取样品袋中5个不同部位的单粒大豆，每个部位2个平行，研磨成粉末制样，其中仍然为阳性者即为含有杂交品系。

表2 引物探针序列

2 结果与讨论

2.1 品系筛查结果

实验对45批样品按表1进行16种转基因大豆品系检测分析，结果见表3。由表3可知，45批样品中均检测到GTS-40-3-2品系；30批样品检测到MON89788品系，占所检测样品66.7%；14批样品检测到A2704-12品系，占所检测样品31.1%；2批样品检测到MON87701品系，占所检测样品4.4%；1批样品检测到MON87701×MON89788品系，占所检测样品2.2%；其他品系在45批样品中均未检测到。

表3 45批样品的转基因大豆品系检测结果

2.2 主要的进口国家筛查结果

对美国、阿根廷、巴西、乌拉圭、加拿大的品系分布和筛查结果见表4。由表4可知，美国作为主要的转基因大豆出口国，在转基因品系上除了GTS-40-3-2以外，MON89788也是其主要的转基因大豆品系，检出率高达96.0%。阿根廷、巴西的转基因品系也在不断增加中，分别检测到了5种和4种。

2.3 讨论

近年来我国对转基因农产品的科研开发和引进都持开放态度，我国目前转基因农产品产业化趋势也在不断地推进过程中，国外对我国农产品出口的转基因品系种类也会不断增加。 因此，目前对转基因大豆的检测需求已经不单单停留在筛查CaMV 35S、NOS、CP4 EPSPS等外源基因上，转基因大豆品系检测能够提供明确的大豆品系，获得可追溯的数据，也能够反映出更多的转基因作物的种植和贸易信息，将是新形势下转基因检测的发展方向。

从本次转基因品系筛查的结果看，没有检测到未经批准进口的转基因大豆品系，说明河北主要进口口岸进口的转基因大豆均符合我国进口大豆转基因安全方面的要求，现阶段总体进口风险较低。但从主要进口国品系的分布情况来看，进口国的转基因大豆的品系越来越多样化，随着主要进口国转基因品系种植品种的增加，进口的转基因大豆品种也逐渐多元化。例如美国大豆由最初只种植GTS-40-3-2品系大豆，到目前为止GTS-40-3-2、MON89788几乎全部检出。此次在巴西和阿根廷大豆中也检测到了我国2013年6月新批准的MON87701、MON87701×MON89788品系大豆，并且巴西和阿根廷的转基因品系也分别增加到了4种和5种。这些都说明进口国的种植品系在不断地丰富，新的耐除草剂、抗虫大豆品种以及杂交品种将持续地增加，进口到非法转基因品系的潜在风险在增加。我国是最早培育和种植大豆的国家，种质资源丰富，品质优良[8]，但由于生产成本较高，近年来不断地受到国外转基因的冲击[9]。同时，转基因大豆品系的不断增加也使得发生基因漂移等对环境和种质资源影响的风险增大[10]。

另外，转基因大豆品系检测仍然存在一些不足[7]，尤其在取样、制样环节，样品的代表性依然是限制检测结果准确性的环节。目前进口转基因大豆检测按进口大豆操作规程取样，但是船舱的容量大、货物多，如何提高全船混合样品的代表性，尤其是杂交品系的代表性将是提高检测结果的准确性的重要途径。

3 结 论

实时荧光PCR法具有快速准确、灵敏度高、污染低等优点，目前已成为主要的转基因品系检测方法。本文收集整理并建立的16种转基因大豆品系的实时荧光PCR的检测方法，可对目前国际上主要的转基因大豆品系进行系统检测，有效补充了国内现有转基因大豆品系的检测方法和标准的不足，为转基因大豆的品系研究提供了参考。

从对河北主要进口口岸转基因大豆品系筛查结果来看，转基因品系呈现增多的趋势，对进口转基因大豆污染方面的筛查仍然需要持续的保持关注。

[1] 张婷婷．中国转基因农产品进口规制研究[J].粮食科技与经济，2015(4)：14-16.

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[3] 崔宁波，宋秀娟.国外转基因大豆种植与育种研究进展[J].东北农业大学学报，2015(8):103-108.

[4] 周静，谷强平，杜吉到.中国大豆进口依赖性及其对大豆进口安全的影响[J].大豆科学，2015(6):503-506.

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[6] 梁靓，李毅然.转基因植物及其产品的应用价值和安全风险展望[J].食品安全质量检测学报，2015(11)：4373-4377.

[7] 华丽，陈萍，鲍洪恩，等.进境大豆存在问题及检验检疫监管对策[J].大豆科技，2014(4)：42-44.

[8] 王乐，赵晓婷.黑龙江省2014 年大豆转基因情况普查与分析报告[J].中国油脂，2015,40(10)：1-5.

[9] 蒋新正.对中国大豆综合产业情况的分析及建议[J].中国油脂，2007,32(3)：11-15.

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Screening of 16 kinds of transgenic soybean strains by real-time fluorescence PCR method

QIAN Yunkai，GAO Fei，WANG Haiyang，CUI Zongyan，WU Xi，XIAO Yanxia

(Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Qinhuangdao 066004，Hebei,China)

16 kinds of transgenic soybean strains of 45 batches of transgenic soybean from two main ports for importation transgenic soybean in Hebei province Qinhuangdao port and Jingtang port were screened by real-time fluorescence PCR method(RT-PCR). The results showed that GTS-40-3-2 strains, MON89788 strains, A2704-12 strains,MON87701 strains and MON87701 × MON89788 strains were detected in transgenic soybean,and the detected batches were 45,30,14,2 and 1 respectively, which accounted for 100%, 66.7%,31.1%,4.4% and 2.2% of all the samples, respectively; other transgenic soybean strains were not detected in all the 45 batches of transgenic soybean. The screening of transgenic soybean strains from the main importation ports in Hebei province provided data support for importation controls of transgenic soybean strains in China.

transgenic soybean; real-time fluorescence PCR; importation; strain

表4 主要大豆进口国转基因大豆品系检测结果

2016-05-13；

2016-11-07

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2015IK109，2015IK228)

钱云开(1982)，男，高级工程师，博士，研究方向为食品生物安全(E-mail)qyk-1@163.com。

王海洋，高级工程师，硕士(E-mail)lab086@163.com。

TS222;S502.3

A

1003-7969(2017)02-0141-05