siRNA干扰FOXF2对人宫颈癌SiHa细胞体外转移的影响

刘丽敏++++++史文娟++++++何芳++++++伍雪梅

[摘要]目的 研究siRNA干扰叉头框转录因子F2（FOXF2）对人宫颈癌SiHa细胞体外转移能力的影响及其作用机制。方法 采用RT-PCR、Western blot分别检测siRNA-FOXF2转染前后，SiHa细胞中FOXF2 mRNA、蛋白的表达变化；同时用划痕试验和Transwell侵袭试验分别检测siRNA-FOXF2转染前后细胞的迁移和侵袭能力，CCK8检测siRNA-FOXF2转染前后细胞的增殖能力。结果 SiHa细胞内FOXF2敲除后，RT-PCR、WB检测显示siRNA-FOXF2转染组FOXF2的蛋白、mRNA均明显下降；划痕试验和Transwell侵袭试验显示细胞侵袭、迁移能力增强；CCK8检测显示siRNA-FOXF2转染组促进细胞增殖能力（P<0.01）。结论 siRNA干扰FOXF2促进SiHa细胞的体外转移能力及细胞增殖能力，进而促进宫颈癌的发生发展。

[关键词]宫颈癌；叉头框转录因子F2；SiHa细胞；细胞迁移；细胞侵袭；细胞增殖

[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）03（c）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the effect of siRNA silencing FOXF2 on invitro metastasis of human cervical carcinoma SiHa cells and its mechanism.Methods The expression of FOXF2 mRNA and protein in SiHa-siRNA-FOXF2 cells and negative control cells were detected by RT-PCR and Western blot respectively. The migration and invasion ability of cells were detected by wound-healing assay and Transwell assay before and after siRNA-FOXF2 transfection.CCK8 was used to detect the proliferation of cells before and after siRNA-FOXF2 transfection.Results The expression of FOXF2 mRNA and protein in siRNA-FOXF2 transfected group was significantly decreased after FOXF2 knockout in SiHa cells by RT-PCR and WB detection；the invasion and migration were enhanced by wound-healing assay and transwell assay.After transfection of siRNA-FOXF2 into cervical cancer SiHa cell lines，the capability of cell proliferation was significantly enhanced （P<0.01）.Conclusion siRNA-FOXF2 can promote the invitro metastasis and proliferation of SiHa cells，and promote the development of cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer；FOXF2；SiHa cells；Cell invasion；Cell migration；Cell proliferation

宫颈癌是临床常见的妇科恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤第3位，死亡率居第4位[1]，且发病趋势呈低龄化[2]。目前主要的治疗方法是宫颈癌根治术和放化疗，其对早期患者的治愈率高达80%～95%，但对于晚期和复发转移的患者仍无令人满意的治疗方法。因此，从分子水平研究宫颈癌的发病和预防机制，采取针对性的靶向治疗迫在眉睫。叉头框转录因子F2（forkhead boxF2，FOXF2）蛋白为FOX转录因子家族中的成员之一，主要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等系统器官的邻近上皮间质细胞，其参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成[3]、胚胎及组织发育[4]以及上皮与间质之间的相互转化[5]等。有研究报道，FOXF2的低表达与乳腺癌的发生和转移密切相關[6]，FOXF2高表达于正常前列腺组织和前列腺良性肿瘤，低表达于前列腺癌及淋巴结转移[7-8]。但目前有关FOXF2基因在宫颈癌分子机制研究的相关报道较少。本研究旨在探讨FOXF2干扰宫颈癌SiHa细胞的分子机制，为临床治疗宫颈癌的靶点提供理论依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

人宫颈癌细胞株SiHa购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库；DMEM购自美国Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，natocor）、Transwell小室购自美国Corning公司。转染试剂脂质体Lipofectamine TM 3000（LTP03000）和OptiMEMⅠ Medium购自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。FOXF2 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，包含3对目的siRNA，1对阴性对照siRNA。Si-FOXF2 1415序列为：5′-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3′；Si-FOXF2 1305序列为：5′-GCAUCACUCUACUCCAGUGTT-3′；Si-FOXF2 650序列为：5′-CCAGCGAGUUCAUGUUCGATT-3′；干扰阴性对照组siRNA序列为：5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′，RT-PCR试剂Takara，日本。

1.2方法

1.2.1细胞培养 SiHa细胞复苏后，加入含10%FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的DEME中培养，置入37℃、5%CO2培养箱内，24 h内换液。取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化、传代、冻存。

1.2.2细胞转染 将培养SiHa细胞分为5组：转染阴性对照组（阴性）、Si-FOXF2 1415组（1415）、Si-FOXF2 1305组（1305）、Si-FOXF2 650组（650）及未经任何处理的SiHa细胞作为对照组（NC）。转染前一天将SiHa细胞接种于6孔板中，转染时细胞融合达到30%～50%，PBS清洗3遍，每孔加入900 μl无血清培养基。将5 μl的siRNA和3 μl的Lipo3000分别与50 μl的OptiMEMⅠMedium混悬，轻轻混匀后静置5 min。将含有siRNA和Lipo3000的OptiMEMⅠ Medium轻轻混匀后静置20 min。将每孔100 μl混匀的DNA脂质体复合物均匀滴入含有无血清培养基的细胞中。48 h后终止提样。

1.2.3 RT-PCR检测各组FOXF2 mRNA的表达 终点提取RNA，采用紫外/可见光分光光度仪测量细胞样品总RNA的浓度和纯度[D（260 nm）/D（280 nm）分析RNA浓度在1.9～2.1之间提示RNA质量良好]。随后按Takara反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。设计引物序列为：FOXF2上游：5′-TCGCTGGAGCAGAGCTACTT-3′；下游：5′-CCCATTGAAGTTGAGGACGA-3′；GAPDH上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。最终获得转染率最高的SI-FOXF2序列。

1.2.4蛋白印迹法检测筛选后的3组FOXF2蛋白的表达 按上述方法转染细胞，分为Si-FOXF2阴性对照组、Si-FOXF2组和未经任何处理的SiHa细胞作为对照组。72 h后用全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，南京）提取蛋白，BCA蛋白试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，北京）测蛋白浓度，以GAPDH为内参，按10%分离胶、6%浓缩胶浓度制胶，按浓缩胶80 V、分离胶120 V恒压电泳，200 mA转膜1 h，5%BSA封闭2 h，TBST洗涤后孵一抗（兔抗人FOXF2 1∶1000，兔抗人GAPDH 1∶10000，Abcam）4℃过夜，次日洗涤后二抗（羊抗兔1∶2000，CST）1 h，洗涤，ECL显影（merckmillipore）。实验重复3次。

1.2.5细胞划痕实验 待转染后细胞数达90%生长融合时，用200 μl移液枪头沿培养板底部呈一字型划痕，用PBS洗3遍，换上无血清的培养基，分别于培养0、12、24、36、48 h在倒置显微镜下（10×10）测量划痕的宽度。细胞迁移率（%）=（1-即时划痕宽度/原始划痕宽度）×100%。

1.2.6 Transwell侵袭试验 用50 μl Matrigel稀释液（1∶4）包被Transwell小室。取Si-FOXF2阴性对照组（Si-Ha NC组）、Si-FOXF2 650组和未处理SiHa组（SiHs组）的细胞，用无血清培养基重悬细胞，上室加入200 μl（3×104）细胞悬液，下室加入含20%FBS的DMEM培养液500 μl，每组重复3孔，培养箱内常规培养48 h。取出小室，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3遍，用棉签擦去上室细胞，结晶紫染色30 min，洗涤，倒置，风干，显微镜下拍照。每个滤膜随机选取5个200倍视野，计数穿膜细胞数，以此表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.2.7 CCK8检测细胞增殖实验 取转染24 h后Si-FOXF2阴性对照组（SiHs组）、si-FOXF2 650组和未处理SiHa组的细胞（SiHa Nc组），用10%FBS血清培养基重悬细胞，在96孔板中加入100 μl（9×103）的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24 h。PBS洗涤3遍，将每孔加入10 μl CCK8及90 μl无血清培养液的混合液，避光，将培养板在培养箱内孵育1～4 h。酶标仪测定450 nm处的吸光值。计算细胞活性公式：细胞增值率（%）=[处理组D（450 nm）-空白孔D（450 nm））/（空白对照组D（450 nm）-空白孔D（450 nm）]×100%。

1.2.8統计学处理 采用GraphPad Prism软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 siRNA-FOXF2干扰对SiHa细胞FOXF2 mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示：3对目的siRNA-FOXF2干扰后FOXF2 mRNA较转染阴性对照组及对照组明显下降（70%～85%），siRNA-FOXF2 650链下降最明显，差异有统计学意义（P<0.01）。选取siRNA-FOXF2 650链进行后续实验（图1）。

2.2 siRNA-FOXF2干扰对SiHa细胞FOXF2蛋白表达的影响

Western blot结果显示：siRNA-FOXF2 650干扰后，siRNA-FOXF2 650组细胞FOXF2蛋白表达水平明显低于转染阴性对照组及对照组，差异有统计学意义（P<0.01），进一步证实转染成功（图2）。

2.3 siRNA-FOXF2干扰对SiHa细胞迁移力的影响

细胞划痕试验显示，siRNA-FOXF2干扰后，siRNA-FOX F2 650组细胞的迁移能力明显高于转染阴性对照组及对照组（P<0.01）（图3）。

2.4 siRNA-FOXF2干扰对SiHa细胞侵袭力的影响

Transwell侵袭试验显示，转染组穿过小室滤膜的SiHa细胞数明显多于转染阴性对照组及对照组，即siRNA-FOXF2 650组细胞侵袭能力高于转染阴性对照组及对照组（图4）。

2.5 CCK8检测siRNA-FOXF2干扰对SiHa细胞增殖的影响

CCK8实验结果显示：siRNA-FOXF2 650组细胞增殖率明显高于阴性转染对照组及对照组（P<0.01）（图5）。

3讨论

宫颈癌严重威胁女性健康，发病率逐渐上升，仅次于乳腺癌，且呈现年轻化趋势[9-10]。宫颈癌的侵袭性强，发生盆腔转移的宫颈癌患者其术后复发率约为70%[11]。宫颈癌变是外源性和内源性多个致癌因素致使抑癌基因失活以及致癌基因激活作用下形成的一个漫长复杂的过程[12]。临床追踪观察所显示，一般从宫颈癌前病变逐渐演变成宫颈癌的时间大约为10年[13]。从这一时间来看宫颈癌是可以预防、早期发现且可以治愈的肿瘤。防治的突破点在于宫颈癌前病变的及时发现、及时治疗，阻断其向宫颈癌的进一步发展，因此探索宫颈癌发生及发展的分子机制对于宫颈癌的治疗有着至关重要的意义。

FOXF2基因位于人染色体6p25.3，编码一含有444个氨基酸的DNA结合蛋白，其分子量大约为46 KD[14]。FOXF2是间质特异性的转录因子，主要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等器官的邻近上皮间质细胞，其参与ECM合成[3]、胚胎及组织发育[4]、以及上皮与间质之间的相互转化[5]等。FOXF2通过调节细胞的极性进而维持组织的稳态，其在胚胎发育及组织分化的过程中发挥着重要作用[15]。FOXF2作为FOX家族中的一员，对抑制恶性肿瘤的发生发展起着重要的作用，而且发现FOXF2在许多恶性肿瘤中的表达较低[16]，而且FOXF2的低表达加快了肿瘤的生长、进展，预示着患者预后较差[17]。也有研究报道FOXF2基因低表达能够促进小鼠肠道腺瘤的形成和生长[18]。siRNA干扰FOXF2在小细胞肝癌中促进细胞增殖和抗细胞凋亡[6]，这与本研究结果一致，干扰FOXF2后促进SiHa细胞的迁移、侵袭、增殖。siRNA干扰FOXF2，促进细胞的侵袭及增殖，加快肿瘤的发展，预示着预后不良。从这一角度为宫颈癌转移的分子机制提供了理论证据。但本研究仍有一定的局限性，僅在体外细胞水平得到了验证，体内实验有待进一步验证，进而判断其是否可以作为临床评估宫颈癌的预后指标。下一步将研究上调FOXF2基因对宫颈癌SiHa细胞作用的分子机制，进而为FOXF2基因的靶点肿瘤防治研究提供进一步的的实验依据和新思路。

[参考文献]

[1]Oei AL，van Leeuwen CM，Ten CR，et al.Hyperthermia selectively targets human papillomavirus in cervical tumors via p53-dependent apoptosis[J].Cancer Res，2015，75（23）：5120-5129.

[2]韩娜娜，邵文裕，刘开江，等.Ib2期巨块型宫颈癌术前不同治疗方法的疗效观察[J].中国癌症杂志，2015，25（1）：56-62.

[3]Ormestad M，Astorga J，Landgren H，et al.Foxf1 and Foxf2 control murine gut development by limiting mesenchymal Wnt signaling and promoting extracellular matrix production[J].Development，2006，133（5）：833-843.

[4]Wang T，Tamakoshi T，Uezato T，et al.Forkhead transcription factor Foxf2（LUN） -deficient mice exhibit abnormal development of secondary palate [J].Dev Biol，2003，259（1）：83-94.

[5]Aitola M，Carlsson P，Mahlapuu M，et al.Forkhead transcription factor FoxF2 is expressed in mesodermal tissues involved in epithelio-mesenchymal interactions[J].Dev Dyn，2000，218（1）：136-149.

[6]Shi Z，Liu J，Yu X，et al.Loss of FOXF2 expression predicts poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients[J].Annals Surg Oncology，2016，23（1）：211-217.

[7]Heul NL，Hendriksen PJ，Kwast TH，et al.Gene expression profiling of the human prostate zones[J].BJU Int，2006，98（4）：886-897.

[8]Hirata H，Ueno K，Shahryari V，et al.MicroRNA-182-5p promotes cell invasion and proliferation by down regulating FOXF2，RECK and MTSS1 genes in human prostate cancer[J].PLoS One，2013，8（1）：e55502.

[9]刘赟赟，王克芳，邱淑兰，等.腺苷酸活化蛋白激酶α在宫颈癌中的表达及其作用机制[J].中国医药，2016，11（3）：419-423.

[10]Lertkhachonsuk AA，Yip CH，Khuhaprema T，et al.Cancer prevention in Asia： resource-stratified guidelines from the Asian Oncology Summit 2013[J].Lancet Oncol，2013，14（12）：497-507.

[11]Arbyn M，Castellsagué X，De SS，et al.Worldwide burden of cervical cancer in 2008[J].Ann Oncol，2011，22（12）：2675-2686.

[12]趙金燕，陈庆，符生鱼，等.siRNA干扰MeCP2基因对宫颈癌Hela细胞的生物学影响[J].兰州大学学报（医学版），2016，42（4）：27-32.

[13]Peirson L，Fitzpatrick Lewis D，Ciliska D，et al.Screening for cervical cancer：a systematic review and meta-analysis[J].Syst Rev，2013，2（1）：1-14.

[14]Tian HP，Lun SM，Huang HJ，et al. DNA methylation affects the SP1-regulated transcription of FOXF2 in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2015，290（31）：19173-19183.

[15]Cai J，Tian AX，Wang QS，et al.FOXF2 suppresses the FOXC2-mediated epithelial-mesenchymal transition and multidrug resistance of basal-like breast cancer[J].Cancer Lett，2015，367（2）：129-137.

[16]Myatt SS，Lam EWF.The emerging roles of forkhead box（Fox）proteins in cancer[J].Nat Rev Cancer，2007，7（11）：847-859.

[17]Kong PZ，Yang F，Li L，et al. Decreased FOXF2 mRNA expression indicates early-onset metastasis and poor prognosis for breast cancer patients with histological grade Ⅱ tumor[J].Plos One，2013，8（4）：e61591.

[18]Nik AM，Reyahi A，Pontén F，et al.Foxf2 in intestinal fibroblasts reduces numbers of Lgr5（+）stem cells and adenoma formation by inhibiting Wnt signaling[J].Gastroenterology，2013，144（5）：1001-1011.