EGR-1及MMP-9在子宫内膜异位症中的表达及意义

林杰，赖志文，林洁，徐庆，冉旭

(自贡市妇幼保健院遗传生殖中心，四川自贡643000)

EGR-1及MMP-9在子宫内膜异位症中的表达及意义

林杰，赖志文，林洁，徐庆，冉旭

(自贡市妇幼保健院遗传生殖中心，四川自贡643000)

目的研究早期生长反应基因-1(EGR-1)与金属基质蛋白酶-9(MMP-9)在子宫内膜异位症患者异位内膜与在位内膜细胞中的表达情况及临床意义。方法收集45例2014年5月至2015年3月于四川省自贡市妇幼保健院确诊的子宫内膜异位症患者的异位内膜及在位内膜，同期收集30例非子宫内膜异位症患者的正常内膜组织。通过免疫组化二步法对三种内膜组织中EGR-1、MMP-9的表达情况进行分析。结果EGR-1在子宫内膜异位症患者异位内膜(84.44%)与在位内膜(73.33%)腺上皮细胞中的阳性检测率显著高于正常内膜组(40.0%)，差异有统计学意义(P＜0.05)，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)；而不同内膜间质细胞中EGR-1的阳性检出率异位内膜为48.89%，在位内膜为44.44%，正常内膜为43.33%，三者比较差异无统计学意义(P＞0.05)；异位内膜和在位内膜腺上皮细胞(在位内膜88.89%、异位内膜64.44%)及间质细胞(在位内膜66.67%、异位内膜42.22%)中MMP-9的阳性检出率均显著高于正常内膜组(腺上皮细胞33.33%、间质细胞16.67%)，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，且异位内膜组显著高于在位内膜组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论检测EGR-1、MMP-9的表达可用于判断子宫内膜异位症的侵袭转移和评估预后。

早期生长反应基因-1；金属基质蛋白酶-9；子宫内膜异位症；免疫组织化学；表达；临床意义

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)简称内异症，是一种临床常见的妇科疾病，但其发生机制目前仍尚未明确。相关研究表明，子宫内膜随经血逆流至腹腔，经过粘附、侵袭及形成新生血管等过程提供了异位内膜成长的必要条件。子宫内膜异位症与恶性肿瘤表型侵袭能力的相似，二者可能存在共有的分子生物学基础[1]。金属基质蛋白酶9(matrix metallo proteinase，MMP-9)是金属基质蛋白酶(matrix metallo Proteinase，MMPS)家族中分子量最大的明胶酶。目前研究认为MMP-9在子宫内膜细胞的异位粘附、种植和生长的过程中发挥了重要作用[2]。而研究发现，早期生长反应基因-1 (early growth response gene-1，EGR-1)可上调MMP-9表达，是促进肿瘤细胞粘附和侵蚀的重要转录因子[3]，但EGR-1在脱落的内膜细胞种植过程中中是否发挥同等重要的作用，还有待进一步的确定。本研究旨在探讨EGR-1、MMP-9与子宫内膜异位症发生及发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料实验组共采集得到45份异位内膜和在位内膜，采集对象为2014年5月至2015年3月期间在自贡市妇幼保健院妇产科住院手术的患者。患者年龄23～45周岁，平均32.5岁。其中，在位内膜增生期和分泌期患者分别为39例与6例。对照组选取同期在本院因其他原因进行手术治疗但子宫内膜正常的30例非EMs患者，年龄31～47周岁，平均37.4岁，其中增生期22例，分泌期8例。EMs与非EMs患者月经周期均表现正常，且近3个月内未使用过任何激素类药物。同时排除患有多囊卵巢综合征、甲状腺疾病、糖尿病等异常情况。

1.2 方法

1.2.1 样品采集在手术过程中分别收集卵巢子宫内膜异位囊肿患者的囊壁组织、在位内膜组织及对照组正常子宫内膜，立即进行多聚甲醛固定、石蜡包埋，最终经病理医师检查证实。对于非全子宫切除的患者，需征得知情同意。手术过程中通过取内膜器直接采集患者子宫内膜。

1.2.2 免疫组化检测本研究采用链霉亲和素-生物素复合物(strept Avidin-Biotin Complex，SABC)法进行免疫组化分析，EGR-1、MMP-9多克隆抗体均购自美国Santa Cruz生物技术公司，SABC三步法试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，具体操作步骤详见说明书。实验过程中阳性对照为已知的阳性乳腺癌切片，阴性对照组一抗以PBS代替。

1.2.3 结果评判标准通过双盲法建立具体的评分标准。每张切片随机选取10个代表性高倍视野进行观察，并记录每个视野下100个细胞中的阳性细胞(细胞内出现黄色颗粒即可判定为阳性细胞)的数量，结果以平均值表示。评分标准及对应关系详见表1。最终以染色强度和染色细胞所占面积的积分之和作为判别阴性和阳性依据。若积分和为0，则判定记过为阴性(-)；若积分和为1～2，则判定结果为弱阳性(+)；同理，积分和为3～4、5～6分别判定结果为阳性(++)和强阳性(+++)。

表1 染色强度与染色细胞所占面积评分标准

1.3 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用秩和检验；EGR-1与MMP-9表达的相关性则采用Spearman相关性分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGR-1在不同子宫内膜组织中的表达如图1中A、B、C所示，EGR-1由腺细胞和间质细胞的细胞核表达。EGR-1在异位内膜腺细胞中的表达量显著高于在位内膜和正常内膜腺细胞中的表达，差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)，而在位内膜腺细胞中EGR-1的表达量明显高于在正常内膜腺细胞中的表达，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；不同内膜间质细胞中EGR-1的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。异位内膜和在位内膜中腺上皮细胞EGR-1的表达显著高于间质细胞中的表达；而正常内膜中间质细胞EGR-1的表达略高于腺上皮细胞，但差异无统计学意义(P＞0.05)。各组中EGR-1的表达统计情况见表2。

图1 不同子宫内膜组织中EGR-1、MMP-9蛋白免疫组化染色结果(×200)

表2 EGR-1在不同子宫内膜中的表达(例)

2.2 MMP-9在不同内膜组织中的表达如图1中D、E、F所示，MMP-9的表达分布于腺细胞和间质细胞的胞浆。经过统计学分析发现，MMP-9在异位内膜腺细胞中的表达量显著高于在位内膜和正常内膜腺细胞中的表达(P＜0.05、P＜0.01)，而在位内膜腺细胞中MMP-9的表达量明显高于正常内膜腺细胞，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；此外，MMP-9在异位内膜间质细胞中的表达量显著高于在位内膜和正常内膜间质细胞中的表达，差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)，而在位内膜间质细胞中MMP-9的表达量明显高于在正常内膜间质细胞中的表达，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。同一内膜中，MMP-9在腺上皮细胞中的表达量明显高于间质细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组内膜中MMP-9的表达情况见表3。

表3 MMP-9在异位内膜、在位内膜和正常子宫内膜中的表达(例)

2.3 异位内膜、在位内膜中EGR-1、MMP-9表达的相关性异位内膜腺上皮细胞和间质细胞中EGR-1、MMP-9表达的相关系数分别为0.876和0.812(P均＜0.01)。而在位内膜腺上皮细胞和间质细胞中EGR-1、MMP-9表达的相关系数分别为0.969和0.934(P均＜0.01)。二者在异位内膜和在位内膜细胞中的表达均显著相关。

3 讨论

子宫内膜异位症是一种较常见的妇科疾病，病理表现主要为子宫内膜组织生长于子宫腔外，如子宫肌层、卵巢或盆腔内的其他部位。此外，患者还常伴有月经不调、痛经甚至不孕等症状。而目前其发病机制仍未完全明确，即使是此前较公认的子宫内膜种植学说也无法合理阐释90%左右妇女在月经来潮时存在经血逆流，EMs的发生率却不足15%等临床表现。近年来，“在位内膜决定论”的观点被大众所接受，该理论指出，在位内膜对于EMs的发生具有关键性作用[4]。

EGR-1属于即刻早期基因家族的一员，可参与细胞的生长、增殖以及凋亡等多种生理过程。其表达受有丝分裂原、生长因子、细胞因子、缺氧、雌激素等因素介导[5]。相关研究表明，EGR-1可参与子宫内膜上皮细胞的增殖[6]。而本研究发现，EMs患者异位内膜腺上皮细胞中EGR-1的表达量明显高于正常内膜腺上皮细胞，表明EGR-1在异位内膜中的过高表达可能与异位病灶种植后的生长与发展相关。而EGR-1在在位内膜与正常内膜之间存在的表达差异，表明在位内膜在经血逆流时可能更容易发生异位种植。

此外，大量的研究结果表明，依赖于脱落细胞的粘附作用，在足够的血液供给情况下，脱落的子宫内膜成功粘附并种植在腹膜或组织器官上。本研究推测，受到EGR-1正向调控的MMP-9可以促进血管内皮细胞出芽和新生血管形成，促使异位内膜得以种植生长并不断扩大，从而在子宫内膜细胞的异位粘附、种植和生长的过程中发挥了重要作用[7]。本研究发现，MMP-9在异位内膜腺上皮细胞中表达明显高于对照组，据此推测异位内膜中MMP-9高表达可提高异位存活能力，并促成病灶的进一步发展。而在本研究中，MMP-9在在位内膜腺上皮细胞中的表达明显高于对照组，这与Matsuzaki等[8]研究结果存在一致性，也与“在位内膜决定论”的观点相近。同时，本研究结果表明子宫内膜异位症异位内膜腺上皮细胞中MMP-9的表达量显著高于其在在位内膜腺上皮细胞，分析其原因可能受腹腔微环境差异的影响，使得缺氧情况在异位内膜中表现更为严重，而为适应缺氧的条件，EGR-1正向调控MMP-9表达的机制被激活，从而改善了血管生成的能力[5]。

本研究通过免疫组化法分析了内异症患者的异位内膜及在位内膜中EGR-1、MMP-9的表达情况。结果表明，EGR-1、MMP-9在异位内膜和在位内膜中的高表达与EMs的发病机制密切相关，进一步的分析将有助于判断子宫内膜异位症的侵袭转移及评估预后。

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[3]Shin SY,Kim JH,Baker A,et al.Transcription factor Egr-1 is essential for maximal matrix metalloproteinase-9 transcription by tumor necrosis factor alpha[J].Mol Cancer Res,2010,8(4):507-519.

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Expression of EGR-1,MMP-9 in endometriosis of ovary and its clinical significance.

LIN Jie,LAI Zhi-wen,LIN Jie,XU Qing,RAN Xu.Department of Genetic and Reproductive Medicine Center,Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital,Zigong 643000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of early growth response gene-1(EGR-1)and matrix metallo proteinase-9(MMP-9)protein in the ectopic and eutopic endometrium in endometriosis(EMs)patients and its clinical significance.MethodsThe expression of EGR-1 and MMP-9 protein in ectopic and entopic endometrium tissues from 45 patients with EMs and endometrium tissues from 30 patients with normal endometrium in Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital from May 2014 to March 2015 were detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of expression of EGR-1 in glandular cell in ectopic(84.44%)or eutopic endometrium(73.33%)of the patients with EMs were significantly higher than that in control group(40.0%)(P＜0.05),but no significant difference between ectopic and eutopic endometrium was found(P＞0.05).There were no significant differences in the positive expression rate of EGR-1 in stromal cells in ectopic endometrium(48.89%),eutopic endometrium(44.44%)or normal endometrium(43.33%)(P＞0.05);The positive expression rate of MMP-9 in glandular and stromal cells in ectopic (glandular cells 88.89%,stromal cells 66.67%)or eutopic endometrium(glandular cells 64.44%,stromal cells 42.22%)of the patients with EMs were significantly higher than those in control group(glandular cells 33.33%,stromal cells 16.67%) (P＜0.01),and the positive expression rate in ectopic endometrium were significantly higher than in that in eutopic endometrium(P＜0.05).ConclusionThe expression of EGR-1 and MMP-9 in ectopic and eutopic endometrium may play an important role in the invasion of endometriosis and metastasis of EMs as well as evaluation of prognosis.

Early growth response gene-1;Matrix metallo proteinase-9;Endometriosis;Immunohistochemistry;Expression;Clinical significance

R711.74

A

1003—6350（2017）07—1101—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.025

2016-10-10)

林杰。E-mail：727064716@qq.com