10种中药提取物抗念珠菌体外药敏实验

卢祥婷 黄欣

(上海市同济医院，同济大学附属同济医院皮肤科，上海 200065)

·论著·

10种中药提取物抗念珠菌体外药敏实验

卢祥婷 黄欣

(上海市同济医院，同济大学附属同济医院皮肤科，上海 200065)

目的 观察10种中药提取物对念珠菌体外抗菌效果。方法 参照CLSI的M27-A3方案，采用微量液基稀释法，检测10种中药提取物抗念珠菌的作用。结果 10种中药提取物中白念珠菌对三七总皂甙、人参茎叶总皂甙较敏感，24 h MIC均为62.5 μg/mL，48 h MIC均为125 μg/mL；24 h时克柔念珠菌对三七总皂甙和柠檬酸较敏感，MIC均为1.96 μg/mL，48 h时克柔念珠菌对三七总皂甙较敏感，MIC为31.25 μg/mL；近平滑念珠菌对人参茎叶皂苷和麝香草酚较敏感，24 h MIC均为3.91 μg/mL，近平滑念珠菌在48 h对人参茎叶皂甙较敏感,MIC为15.63 μg/mL。结论 三七总皂甙、人参茎叶皂甙、柠檬酸和麝香草酚对念珠菌具有一定的抗菌活性，不同中药提取物针对念珠菌不同菌种的抗菌作用存在一定差异。

中药提取物；念珠菌；药敏试验

念珠菌是一种临床上常见的致病真菌，可引起皮肤、黏膜及内脏系统的感染，其中侵袭性念珠菌病的死亡率高达47%[1]，临床上白念珠菌的感染约占80%以上[2]。抗真菌药物种类较为局限，临床治愈率较低，容易出现耐药，部分药物不良反应明显，因此开发高效、低毒的抗真菌药物显得尤为重要和迫切。本研究参照美国国家临床实验室标准化研究所 (Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI)制订的M27-A3方案中酵母菌微量液基稀释法检测了10种中药提取物对念珠菌的体外药敏试验，旨在初步筛选出对念珠菌有抗菌作用的中药提取物。

1 材料和方法

1.1 实验材料

菌株来源 白念珠菌 (ATCC10231)，中国医学细菌保藏管理中心惠赠。克柔念珠菌 (ATCC6258)与近平滑念珠菌 (ATCC22019)均由上海第二军医大学长征医院卫生部真菌保藏中心惠赠。

抗真菌药物 氟康唑粉 (含量99.9%)、伊曲康唑粉 (含量99.9%)均由西安杨森制药有限公司提供；鱼腥草素钠、麝香草酚、丹皮酚、肉桂酸、银杏叶对照提取物、柠檬酸、青篙琥酯、人参茎叶皂甙、三七总皂甙、苦参碱均购自中国药品生物制品检定所。

主要试剂和仪器 二甲基亚砜 (Merck公司)，RPMI 1640粉末 (美国Gibco公司)，沙氏培养基原料 (国药集团化学试剂有限公司上海分公司)，电子分析天平 (瑞士MettlerT01edo公司)，电热恒温培养箱 (上海精宏实验设备有限公司)，生物安全柜 (力康生物科技有限公司)，光学显微镜 (Olympus日本)，麦氏比浊管 (法国Biomerieux公司)，血细胞计数板 (上海求精生化试剂仪器有限公司)，96孔细胞培养板 (浙江黄岩塑料制品厂)。

1.2 方法

按照CLSI推荐的微量液基稀释法 (M27-A3)[3]实施。

药物储存液的制备 水溶性的氟康唑溶于灭菌双蒸水，脂溶性的伊曲康唑和10种中药提取物分别溶于二甲基亚砜，制备成药物储存液。氟康唑为256 μg/mL，伊曲康唑为64 μg/mL，10种中药提取物均为1 000 μg/mL。

药物敏感测试板的制备 用RPMI 1640液体培养基将配制好的药物储存液按所需测试浓度的2倍稀释后，加入一次性使用的无菌96孔板第1～10孔，每孔100 μL。第11、12孔分别加入不含药物的RPMI 1640液体培养基100 μL、200 μL，其中第11孔为阳性生长对照，第12 孔为阴性空白对照。

菌悬液的制备和接种 为保证受试菌株的纯度和活力，将其连续转种至沙堡弱斜面培养基2次，35℃培养48 h，用3 mL无菌生理盐水制成菌悬液，于血细胞计数板上调整其浓度至 (1～5)×106CFU/mL。用麦氏比浊管调整为0.5个麦氏单位。用RPMI 1640液体培养基将菌悬液稀释1 000倍。取100 μL接种于药物敏感测试板第1～11孔中。

孵育和终点判定 接种后的药物敏感测试板置于35℃恒温培养箱中培养24 h和48 h，采用视觉法判定终点。药物敏感终点判读参照M27-A3中对微量液体培养基稀释法的标准，唑类药物以50%抑制作为观察终点，判断最低抑菌浓度 (minimuminhibitory concentration，MIC)。中药提取物的结果判断参照唑类药物进行。每种药同时做3排，结果取3个数的平均值。

2 结 果

体外药敏结果 (见表1)显示：10种中药提取物中，白念珠菌标准株 (ATCC10231)24 h时对三七总皂甙和人参茎叶总皂甙较敏感，MIC值均为62.5 μg/mL；48 h时对三七总皂甙、人参茎叶总皂甙的MIC值均为125 μg/mL。10种中药提取物中，克柔念珠菌 (ATCC6258)24 h时对三七总皂甙和柠檬酸的作用较敏感，MIC值均为1.96 μg/mL；48 h结果显示三七总皂甙MIC值为31.25 μg/mL，柠檬酸出现拖尾现象，MIC值为125 μg/mL。10种中药提取物中，近平滑念珠菌 (ATCC22019)24 h时对人参茎叶皂苷和麝香草酚均较敏感，MIC均为3.91 μg/mL,48 h时对人参茎叶皂甙较敏感,MIC值为15.63 μg/mL,在48 h观察到麝香草酚出现拖尾现象。

表1 10种中药提取物对白念珠菌标准株 (ATCC10231)、克柔念珠菌 (ATCC6258)标准株和近平滑念珠菌 (ATCC22019)标准株的24 h和48 h MIC值 (μg/mL)

Tab.1 The 24 h and 48 h MICs (μg/mL) of 10 kinds of Chinese herb extracts againstC.albicansstandard strain (ATCC10231)，C.kruseistandard strain (ATCC6258) andC.parapsilosisstandard strain (ATCC22019)invitro

药物C.albicansC.kruseiC.parapsilosis24h48h24h48h24h48h鱼腥草素钠>500>5001255007.81>500苦参碱500500500>500>500>500丹皮酚>50050062.5500500>500三七总皂甙62.51251.9631.25125125青篙琥酯50050031.25>50062.562.5肉桂酸250>50031.25250500500柠檬酸2505001.96125125>500人参茎叶皂甙62.512562.52503.9115.63银杏叶对照提取物12512562.525031.25250麝香草酚250>5001255003.91500氟康唑0.250.250.1250.250.1250.5伊曲康唑0.06250.1250.06250.1250.030.03

3 讨 论

近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等的广泛应用，念珠菌病的感染逐年上升，且耐药性问题也越来越严重。因此从中草药提取物中开发高效、低毒的抗真菌药物具有广阔的前景。我们开展了中药提取物对念珠菌的体外药敏试验，从而为念珠菌病的有效治疗提供新的思路。

近几年，国内外对中药抗真菌作用有较多报道，王焕丽等[4]发现了大蒜对白念珠菌生长的抑制效果与氟康唑相似，Yang等[5]的研究发现黄芩苷能抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶 (SDH)的活性，增加细胞内Ca2+含量，继而加速细胞凋亡的速度，Keyal等[6]的研究表明三七总皂甙和人参茎叶皂苷在体外药敏实验中与氟康唑联用具有协同抗氟康唑耐药的白念珠菌作用。在我们的实验中也可以观察到，三七总皂苷与人参茎叶皂苷对克柔念珠菌和近平滑念珠菌也具有一定的抗菌效果。我们的实验选用与念珠菌感染关系较密切的白念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌菌株的标准株作为实验菌株，对10种中药提取物进行了初筛试验，研究结果表明三七总皂甙和人参茎叶总皂甙对白念珠菌标准珠较敏感,24 h MIC均为62.5 μg/mL，而48 h MIC均为125 μg/mL。在克柔念珠菌 (ATCC6258)的体外药敏试验中，其对三七总皂甙和柠檬酸较敏感，24 h MIC均为1.96 μg/mL，在48 h时，克柔念珠菌对三七总皂甙较敏感，MIC为31.25 μg/mL。而在对近平滑念珠菌 (ATCC22019)体外药敏试验中，近平滑念珠菌24 h时对人参茎叶皂苷和麝香草酚均较敏感，MIC均为3.91 μg/mL，48 h时其对人参茎叶皂甙较敏感，MIC为15.63 μg/mL。本实验结果表明不同中药提取物针对念珠菌不同菌种的效果存在一定差异，为进一步筛选有抗真菌作用的中药提取物提供了理论依据。此外，在本实验中柠檬酸和麝香草酚出现拖尾现象，提示虽然“拖尾”现象主要出现在唑类药物中，但在中药提取物抗真菌试验中也有所体现。目前，关于中药提取物抗真菌的体外药敏实验尚无统一标准化实验方案。本实验将 CLSI M27-A3方案用于中药提取物抗念珠菌的体外药敏试验中，具有实验结果易分析，方便，可重复性等优点。该研究的开展可为开发高效低毒的抗真菌药提供理论依据和实验依据。

[1] Pappas PG,Kauffman CA,Andes D,et al.Clinical practice guidelines for the management of candidiasis:2009 update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2009,48(5):503-535.

[2] Sharma Y,Chumber SK,Kaur M.Studying the prevalence,species distribution,and detection ofinvitroproduction of phospholipase fromCandidaisolated from cases of invasive candidiasis[J].J Glob Infect Dis,2017,9(1):8.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts,3rd edition,approved standard M27-A3[S].3rd ed.Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[4] 王焕丽,张锡宝,陈兴平.大蒜素体外抗白念珠菌生物膜作用的初步研究[J].中国真菌学杂志,2010,5(3):129-132.

[5] Yang S,Fu Y,Wu X,et al.Baicalin preventsCandidaalbicansinfections via increasing its apoptosis rate[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,451(1):36-41.

[6] Keyal U,Huang X,Bhatta AK.Drug interaction of traditional Chinese medicines with fluconazole against fluconazole resistant strains ofCandidaalbicans[J].Int J ClinExp Med,2016,9(11):22357-22362.

[本文编辑] 王 飞

Antifungal susceptibilities of ten kinds of traditional Chinese herb extracts againstCandidainvitro

LU Xiang-ting,HUANG Xin

(DepartmentofDermatology,ShanghaiTongjiHospital,AffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China)

Objective To observe the antifungal effect of 10 kinds of traditional Chinese herb extractsinvitro.Methods We performedinvitrodrug susceptibility testing for ten kinds of traditional Chinese herb extracts,fluconazole and itraconazole againstCandidaisolates following CLSI M27-A3 guidelines.Results Panax notoginseng saponins (PNS) and ginseng stem-leave saponins (GSLS) were more sensitive toC.albicans.Their 24 h MIC values were 62.5 μg/mL and the 48 h MIC values were 125 μg/mL.PNS and Citric acid were more sensitive toC.kruseiat 24 h and their MIC values were both 1.96 μg/mL.PNS was more sensitive toC.kruseiat 48 h,the MIC were 31.25 μg/mL.GSLS and Thymolwere more sensitive toC.parapsilosisand their 24 h MICs were both 3.91 μg/mL.GSLS was sensitive toC.parapsilosisat 48 h,the MIC was 15.63 μg/mL.Conclusion PNS,GSLS,Citric acid and Thymol possessed activity againstCandidaisolatesinvitro.There were some differences in antifungal activity of different extracts of Chinese herbs against different kinds ofCandidaspecies.The results provide a theoretical basis for further screening of Chinese herb extracts.

Chinese herb extracts；Candida；drug susceptibility testing

83-85]

上海市科委自然科学基金 (17ZR1426300，13ZR1437900)

卢祥婷，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:lxtns15@163.com

黄欣,E-mail:alida_huang@163.com

R 379.4 R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0083-03

2017-03-15