固相萃取柱法分离sn-2 位单甘酯的研究

杨雅新,汪学德，郑永战

(1.河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001； 2.河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州 450008)

固相萃取柱法分离sn-2 位单甘酯的研究

杨雅新1,汪学德1，郑永战2

(1.河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001； 2.河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州 450008)

为探寻与气相色谱分析相配套的前处理方法，以高效测定油脂中sn-2位(β位)脂肪酸组成及含量。 考察了胰脂酶添加量对甘油三酯酶解程度的影响，并采用Florisil固相萃取柱对酶解产物中sn-2位单甘酯的分离纯化条件进行优化。采用高温气相色谱法分析Florisil 固相萃取柱对油脂酶解产物中sn-2位单甘酯的分离能力，结果表明经过Florisil 固相萃取法分离得到的 sn-2 位单甘酯纯度能达到95%；气相色谱法分析常见的7种油脂的sn-2位脂肪酸组成，结果表明Florisil 固相萃取法与传统薄层色谱法测得的sn-2位脂肪酸组成不存在显著性差异。

油脂；sn-2 位单甘酯；酶解；薄层色谱；Florisil 固相萃取

extraction

甘油三酯(triacylglycerol，TAG)是植物油的主要成分(占95%以上)，由1个甘油分子和3个脂肪酸分子组成，脂肪酸占甘油三酯相对分子质量的95%以上。脂肪酸在甘油三酯骨架上的分布位置有两类:sn-1,3(α)和sn-2(β)。而脂肪酸在甘油三酯中的酰化位置分布与油脂品种、 来源等密切相关，此外各种油脂由于其种类、遗传因子、脂肪酶特性等的不同，油中脂肪酸组成及含量大相径庭。进一步的研究证实，即使是脂肪酸组成相近的不同油脂，脂肪酸碳链长度、双键数、双键位置不同而呈现不同化学和物理性质，对它们的消化和吸收等营养性质，生物合成等生物化学性质，晶体结构、熔点等物理性质都有重大的影响[1-2]，从而影响其在体内的消化过程。对这些影响脂质消化吸收的因素不断深入的研究，使食品工业能够设计生产出增加、减少或者控制脂肪消化和吸收的食物，这对人体健康和疾病预防控制具有重大意义[3]，故油脂中脂肪酸组成固然重要，但脂肪酸位置分布也不容忽视，为此需对油脂的脂肪酸位置分布进行测定[4-5]。

目前，分析油脂中 sn-2 位脂肪酸常用的方法是：首先采用胰脂酶对甘油三酯进行酶解，产物包括甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、单甘酯(MAG)、游离脂肪酸(FFA)，然后将酶解产物经薄层层析(TLC)对酶解产物中的sn-2位单甘酯进行分离纯化，甲酯化后用气相色谱(GC)确定sn-2位单甘酯脂肪酸组成。但TLC法对酶解产物进行分离时，操作流程相对复杂，产物的回收率受操作水平影响较大[6]，而固相萃取(SPE)技术可实现选择性的提取、分离、浓缩三位一体的过程，操作时间短、样品量小、干扰物质少，并具有很好的重现性[7]。随着越来越多的新型吸附剂和新的操作模式的不断涌现， 固相萃取技术作为样品前处理技术成为化学分离和纯化的一个强有力工具，从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离，固相萃取技术在多个领域得到了广泛应用[8]。李兴峰等[9 ]采用氨基(—NH2)固相萃取柱分离、纯化甘油三酯水解产物中的单甘酯。相对于TLC法，简化了操作步骤，提高了分析的准确度，适合用于批量处理样品。吴琳等[10]采用 Florisil 固相萃取柱实现了油脂水解后4种酶解产物TAG、DAG、MAG及FFA的依次分离。为研究与气相色谱分析相配套的前处理方法，以高效测定油脂中sn-2 位脂肪酸组成及含量,本实验研究了胰脂酶添加量对甘油三酯酶解程度的影响，并优化了酶解产物中sn-2位单甘酯的分离条件。在最佳分离条件下采用Florisil 固相萃取法对油脂水解后的4种酶解产物TAG、DAG、MAG、FFA分离，高温气相色谱法对该方法收集的MAG的纯度进行分析，并与传统TCL法测定的油脂sn-2位脂肪酸结果进行比较，进一步验证该方法的可行性，为sn-2 位脂肪酸组成进而为油脂脂肪酸位置分布的研究提供更方便的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

实验采集7种不同种类的食用油样品，其中橄榄油、大豆油为超市购买，芝麻油、花生油、牡丹籽油、葵花籽油、菜籽油为实验室自制低温压榨油。

胰脂酶(10万U/g)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；油酸标准品(≥99%)、油酸甘油一酯标准品(5 000 μg/mL)、油酸甘油二酯标准品(≥95%)、油酸甘油三酯标准品(2 500 mg/mL)：美国Sigma公司；正己烷、乙醚、甲酸、甲醇：均为色谱纯，美国VBS生物公司；Tris试剂、胆酸钠、氯化钙、盐酸溶液、乙醚、甲酸均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

DB-1HT毛细管柱(Agilent,30 m×0.25 mm×0.1 μm)，HP-88毛细管柱(Agilent,100 m×0.25 mm×0.1 μm)；GF254硅胶层析板(20 cm×20 cm)：青岛海洋化工厂； Florisil 固相萃取柱(1 000 mg，6 mL)：Agela公司；Agilent 7890B气相色谱仪配有FID检测器：美国Agilent公司；真空固相萃取装置：Supelco 公司； SC-02台式低速离心机：安徽中科中佳仪器有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；ZF-2型三用紫外仪：上海市安亭电子仪器厂；6YZ-180型全自动液压榨油机。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别移取1 mL的油酸标样、1 mL的油酸甘油一酯标样、1 mL的油酸甘油二酯标样和1 mL的油酸甘油三酯标样，用正己烷溶解并定容于10 mL的容量瓶中，标准储备液置于-20℃的冰箱备用。

1.2.2 油脂酶解产物的制备

取30 mg油样于10 mL离心管中，加入一定量的胰脂酶(sn-1,3专一性脂肪酶)和2 mL Tris-HCl缓冲溶液小心摇动，然后加0.6 mL 胆酸钠溶液(1 g/L)和 0.4 mL 氯化钙溶液(220 g/L)，混合均匀后，立即将离心管放入40℃水浴锅内，振荡5 min，加入1 mL盐酸(6 mol/L)和1 mL乙醚。在4 000 r/min 转速下离心5 min，取上层有机相转入10 mL 离心管中，用氮气吹至近干，得到酶解产物。

1.2.3 薄层色谱分离油脂酶解产物

将1.2.2中的酶解产物复溶于2 mL的乙醚中，用点样针吸取复溶物，并在硅胶板下端1.5 cm处均匀点样，然后置于层析缸中层析，展开剂为正己烷-乙醚-甲酸(体积比为70∶30∶1)。紫外灯下显色，将单甘酯色谱带刮下，分3次萃取后将萃取液合并于离心管中，氮气吹干并用2 mL的正己烷复溶，摇匀，待测。

1.2.4 Florisil固相萃取柱分离油脂酶解产物

(1)Florisil固相萃取柱的活化：向Florisil固相萃取柱中加入6 mL正己烷活化。

(2)油脂酶解产物的分离：将1.2.2中的油脂酶解产物用3 mL的正己烷复溶。上样至活化好的Florisil固相萃取柱中，依次加入正己烷-无水乙醚(体积比为85∶15)、正己烷-无水乙醚(体积比为70∶30)洗脱酶解产物中的甘油三酯和甘油二酯，弃去洗脱液，最后用正己烷-无水乙醚(体积比为25∶75)洗脱单甘酯，收集该部分洗脱液于试管中，氮气吹至近干。用2 mL正己烷溶解，摇匀，待测。

1.2.5 高温气相色谱分析Florisil固相萃取柱分离得到的单甘酯

将1.2.4(2)分离得到的单甘酯待测液进行高温气相色谱分析，根据待测液在色谱峰上的出峰时间与标准样品保留时间的比较，确定MAG是否与FFA、DAG、TAG等产物有效分离。

DB-1HT高温色谱柱分析条件如下：进样口温度380℃；分流比20∶1；检测器温度400℃；升温程序为100℃保持0 min，50℃/min升温至220℃保持0 min，15℃/min升温至290℃保持0 min，40℃/min升温至320℃保持8 min，20℃/min升温至360℃保持9 min；载气为高纯氮气，流速4.41 mL/min；空气流速300 mL/min；氢气流速30 mL/min。

1.2.6 薄层色谱法和Florisil固相萃取柱法分离得到的单甘酯脂肪酸组成测定

将1.2.3和1.2.4中得到的单甘酯甲酯化[11]，进行气相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 甘油三酯酶解条件的确定

酶解步骤按1.2.2进行，胰脂酶的添加量分别设定为 10、20、30、40、50 mg。酶解后通过高温气相色谱测定酶解产物中各组分的含量，结果如表1所示。

表1 不同胰脂酶添加量下酶解产物中各组分的含量

注：表中不同小写字母表示差异显著。

由表1可看出，胰脂酶的添加量从10 mg 增加到 30 mg 时,甘油三酯的含量逐渐减小、游离脂肪酸的含量逐渐增加, 说明随着胰脂酶添加量的增加甘油三酯的酶解程度也逐渐增加。当胰脂酶添加量大于30 mg时,游离脂肪酸含量变化不大 ,说明胰脂酶的添加量为30 mg时甘油三酯基本被完全酶解，因此将胰脂酶的添加量确定为30 mg。

2.2 Florisil固相萃取柱分离sn-2位单甘酯条件的确定

固定甘油二酯部分洗脱液体积为12 mL，单甘酯部分洗脱液体积为10 mL，考察甘油三酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响，结果如图1所示。

图1 甘油三酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响

由图1可看出，当甘油三酯部分洗脱液体积小于14 mL时，随着洗脱液体积的增加所得单甘酯的纯度逐渐升高，当甘油三酯部分洗脱液体积为14 mL时，单甘酯纯度达到最大值89.61%，这可能是由于甘油三酯和脂肪酸的极性比较接近，过量的甘油三酯部分洗脱液也会把大量游离脂肪酸洗脱下来，但如果继续增加甘油三酯部分洗脱液体积，收集的单甘酯纯度无明显变化。因此，选择甘油三酯部分洗脱液体积为14 mL。

固定甘油三酯部分洗脱液体积为14 mL，单甘酯部分洗脱液体积为10 mL，考察甘油二酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响，结果如图2所示。

图2 甘油二酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响

由图2可看出，当甘油二酯部分洗脱液体积小于12 mL时，随着洗脱液体积的增加所得单甘酯的纯度明显升高，当甘油二酯部分洗脱液体积为12 mL时收集的单甘酯纯度达到最大值91.13%，但如果再增加甘油二酯部分洗脱液体积，收集的单甘酯纯度会逐渐降低。可能是由于单甘酯和甘油二酯极性差别不是很大，如果加入过量的甘油二酯洗脱液会使一部分单甘酯也被洗脱下来而导致单甘酯的纯度降低。因此，选择甘油二酯部分洗脱液体积为12 mL。

固定甘油三酯部分洗脱液体积为14 mL，甘油二酯部分洗脱液体积为12 mL，考察单甘酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响，结果如图3所示。

图3 单甘酯部分洗脱液体积对单甘酯纯度的影响

由图3可看出，当单甘酯部分洗脱液体积小于10 mL时，随着洗脱液体积的增加所得单甘酯的纯度逐渐升高，当单甘酯部分洗脱液体积为10 mL时，单甘酯纯度达到最大值95%，但随着单甘酯部分洗脱液体积的增加，收集的单甘酯纯度变化不明显。此外，过多的溶剂添加会致使溶剂、能源的浪费，由此也会增加实验成本。因此，综合考虑选择单甘酯部分洗脱液体积为10 mL。

2.3 标准品高温气相色谱图(见图4～图7)

图4 油酸标准品高温气相色谱图

由图4分析可以得出，高温气相色谱图中游离脂肪酸出峰时间为4.2 min，因此按照气相色谱出峰规律可知4.2 min之前的均为游离脂肪酸。

图5 油酸甘油一酯标准品高温气相色谱图

由图5分析可以得出，高温气相色谱图中油酸甘油一酯出峰时间为5.1 min，因此按照气相色谱出峰规律可知4.2～5.1 min之间的为单甘酯。

图6 油酸甘油二酯标准品高温气相色谱图

由图6分析可以得出，高温气相色谱图中油酸甘油二酯出峰时间为14.6 min，因此按照气相色谱出峰规律可知5.1～14.6 min之间的为甘油二酯。

图7 油酸甘油三酯标准品高温气相色谱图

由图7分析可以得出，高温气相色谱图中油酸甘油三酯出峰时间为24 min之后，因此按照气相色谱出峰规律可知24 min之后的为甘油三酯。

2.4 经Florisil 固相萃取柱分离所得的单甘酯部分高温气相色谱图(见图8)

图8 经Florisil固相萃取柱分离所得单甘酯部分高温气相色谱图

对比分析图4～图7中FFA、MAG、DAG、TAG标准品的高温气相色谱图，由图8可以看出，高温气相色谱分析经Florisil固相萃取柱分离酶解产物所得的sn-2位单甘酯，不仅在TAG位置上没有出现响应，并且DAG、FFA含量也很微小，仅占不足5%，得到的MAG纯度可达到95%，由此得出Florisil固相萃取法可作为与气相色谱法高效分析sn-2位脂肪酸相配套的前处理方法。

2.5 Florisil固相萃取法分离气相色谱法测定不同油脂sn-2位脂肪酸分布

应用Florisil固相萃取柱分离纯化不同油脂酶解产物中的sn-2位单甘酯，通过气相色谱法分析得到总脂肪酸及sn-2位脂肪酸组成及含量，实验结果如表2所示。通过表2计算可知，芝麻油、大豆油、花生油、菜籽油、橄榄油、葵花籽油、牡丹籽油总脂肪酸中不饱和脂肪酸含量分别为85.52%、84.10%、82.06%、93.82%、86.75%、84.94%、91.33%，sn-2位不饱和脂肪酸含量分别为 96.83%、98.05%、94.61%、99.00%、94.25%、98.10%、95.89%，该结果与文献中报道的结果一致[12-14]。由此表明植物油中不饱和脂肪酸主要集中在sn-2位。芝麻油、大豆油、花生油、菜籽油、橄榄油、葵花籽油、牡丹籽油总脂肪酸中油酸含量分别为37.51%、23.02%、46.68%、25.62%、72.48%、17.55%、20.57%，亚油酸含量分别46.82%、53.85%、33.56%、16.83%、12.87%、67.10%、26.88%；而sn-2位油酸含量分别为 41.84%、25.38%、53.71%、36.38%、81.84%、19.38%、31.04%，sn-2位亚油酸含量分别为54.67%、65.79%、39.37%、35.72%、11.86%、78.72%、28.54%，用这种方法测定的结果表明植物油中的油酸、亚油酸大部分与甘油的sn-2位羟基结合，而芝麻油、大豆油、花生油等中的花生酸(C20∶0)、山嵛酸(C22∶0)在sn-2位未检测到，菜籽油中的sn-2位芥酸(C22∶1)占总芥酸含量的13.36%，说明一些稀有脂肪酸如C20及C22多集中在sn-1,3位，这与文献记载一致[1]。并且通过SPSS 20软件对Florisil固相萃取法和传统TLC法得到的sn-2位单甘酯脂肪酸组成进行差异显著性分析，结果表明二者不存在显著性差异。

表2 Florisil固相萃取法与薄层色谱法(TLC)测定不同油脂中sn-2位脂肪酸组成及含量 %

注：“-”表示未检出，“TFA”表示总脂肪酸，“TUFA”表示总不饱和脂肪酸。

3 结 论

实验分别考察了胰脂酶添加量对甘油三酯酶解程度的影响以及洗脱液的体积对所收集单甘酯纯度的影响。结果表明：油脂取样量为30 mg,在不影响sn-2位酰基的情况下，脂肪酶添加量为30 mg时，甘油三酯酶解程度最大；甘油三酯洗脱液体积、甘油二酯洗脱液体积、单甘酯洗脱液体积分别为14、12、10 mL时，经Florisil 固相萃取收集所得sn-2位单甘酯纯度最高；高温气相色谱法检测分析该方法分离4种产物甘油三酯、甘油二酯、单甘酯及游离脂肪酸的分离效果，结果表明该方法能将sn-2位单甘酯与甘油三酯、甘油二酯及游离脂肪酸有效分离，分离得到的目标产物单甘酯纯度可达到95%；Florisil固相萃取法所得sn-2位脂肪酸组成与传统薄层色谱方法所得sn-2位脂肪酸进行对比，二者测定结果不存在显著性差异，且Florisil固相萃取柱操作简单、结果受环境影响因素较小，实验结果准确度高，因此可作为与气相色谱分析相配套的高效前处理方法，以测定油脂中 sn-2 位(β位)脂肪酸组成及含量。

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Separation of sn-2 monoacylglycerol by solid phase extraction column method

YANG Yaxin1, WANG Xuede1, ZHENG Yongzhan2

(1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001,China； 2.Sesame Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450008, China)

A pretreatment method matching with gas chromatographic was found to high-efficiently analyze sn-2 fatty acid composition in oil. The effect of dosage of pancreatic lipase on the enzymolysis degree of triglyceride was investigated and the conditions of separation and purification of sn-2 monoacylglycerol in enzymatic hydrolysis product were optimized using a Florisil solid phase extraction column. The ability of Florisil solid phase extraction column separating sn-2 monoacylglycerol was analyzed by high temperature gas chromatography method. The results showed that the purity of sn-2 monoacylglycerol separated by Florisil solid phase extraction column could reach 95%. The sn-2 fatty acids compositions of seven kinds of common oils were analyzed by gas chromatography method, and the results showed that there was no significant differences between the compositions of sn-2 fatty acids obtained by Florisil solid phase extraction method and traditional thin layer chromatography (TLC).

oil; sn-2 monoacylglycerol; enzymolysis; thin layer chromatography; Florisil solid phase

2016-07-28；

2016-12-12

国家(农业)公益行业专项(201303072-2)；国家“现代农业产业技术体系建设”专项资金(CAR15-1)

杨雅新(1990)，女，硕士研究生，研究方向为油脂与植物蛋白工程(E-mail)1606844615@qq.com。

汪学德，教授(E-mail)wangxuede1962@126.com;郑永战，研究员(E-mail)sesame168@163.com。

TS225.1;TQ646

A

1003-7969(2017)04-0041-06