不同负荷游泳运动对老龄大鼠心肌细胞形态及 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

王永良 刘忠民 刘眉眉 李 静 郑 妍

(吉林大学体育学院，吉林 长春 130012)

不同负荷游泳运动对老龄大鼠心肌细胞形态及 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

王永良 刘忠民 刘眉眉1李 静 郑 妍2

(吉林大学体育学院，吉林 长春 130012)

目的 探讨不同负荷游泳运动对老龄大鼠心肌细胞中Bcl-2、Bax及HIF-1蛋白表达的影响及凋亡机制。方法 将48只22月龄雄性健康Wistar老龄大鼠随机分为对照组(C)、大负荷组(H)、中等负荷组(M)和小负荷组(S)，每组12只，进行为期8 w的不同负荷的游泳运动；运动干预后解剖取样，HE染色观察心肌细胞形态学变化，免疫组织化学检测心肌细胞Bcl-2、Bax和HIF-1蛋白表达。结果 S组老龄大鼠心肌中Bcl-2表达与C组(P<0.01)差异非常显著，H组与C组(P<0.05)差异显著，S组心肌Bax表达与C组(P<0.01)差异非常显著，H组与C组(P<0.05)差异显著，S组心肌细胞HIF-1α表达与C组(P<0.05)差异显著，H组与C组(P<0.01)差异非常显著。适宜的游泳运动(S组)心肌纤维排列有序，细胞间质减少，心肌纤维肥厚，走向正常，着色比较均匀，且未观察到肌丝断裂，也无充血坏死现象发生。S组促进Bcl-2表达增加，Bax蛋白表达降低，进而抑制心肌细胞凋亡发生；大负荷运动或不适宜(H、M组)利于Bcl-2蛋白的表达减少，Bax蛋白的表达升高，进而促进心肌细胞凋亡的发生。结论 Bcl-2、Bax 蛋白表达变化是运动干预心肌细胞凋亡的调控机制之一。

游泳运动；心肌细胞形态；Bcl-2

研究表明〔1〕，长期中等强度的运动可造成大鼠心肌细胞中凋亡调控基因Bcl-2表达明显增加，抑制心肌细胞凋亡；而力竭运动和过度运动可引起心肌细胞中Bcl-2表达下降、调控基因Bax表达显著升高以及凋亡调控基因Bcl-2/Bax比值显著下降，促进心肌细胞凋亡〔2〕。可见，运动负荷对心肌细胞凋亡有一定的影响。本研究拟分析不同运动负荷对心肌细胞Bcl-2和 Bax表达的影响。

1 对象与方法

1.1 动物与分组 22月龄自然老化雄性 Wistar大鼠，生产许可证号：SCXK(吉)2014-0001。48只大鼠体重(561.04±34.53)g；毛色正常，精神状态良好，分笼饲养，每笼6只，温度23℃～25℃，相对湿度50%～60%，自然光照；采用国家标准啮齿类动物专用饲料，自由饮水进食，间隔1 d更换动物垫料。将48只Wistar大鼠随机分为四组(每组12只)：对照组(C自由饲养)、大负荷组(H)、中等负荷组(M)和小负荷组(S)。每周一到周六同一时间进行实验，周日休息一天，每周一测一次体重。

1.2 游泳运动负荷的制定 结合刘忠民等〔3〕的不同负荷定量标准，制定本实验不同组的运动负荷，S、M、H组运动负荷分别为15、30、60 min/d。实验泳池选用高80 cm，直径为60 cm，水深70 cm的圆形桶中进行，实验整个过程水温始终保持在(30±2)℃。为保持老龄大鼠的运动记忆，每天游泳运动安排在统一固定时间进行。

1.3 实验动物取材与免疫组化染色测试 实验结束后即刻对样本大鼠进行解剖以便进行免疫组织化学检测。首先将5 ml/只盐酸利多卡因液麻醉大鼠，然后将其固定于手术台上，打开胸腔暴露心脏，自左心室插管，迅速剪破右心耳，并快速灌注20 ml 0.9%生理盐水冲洗，待见清水流出，随后用4%多聚甲醛溶液缓慢灌注进行固定，直到大鼠全身僵硬，尤其尾部僵硬为止。固定后，提取心脏浸泡于甲醛固定液中，以备进行免疫组化检测。按照免疫组化染色试剂的主要操作过程进行免疫组化阳性细胞判定：心肌细胞中Bcl-2、Bax、缺氧诱导因子(HIF)-1α阳性细胞呈棕黄色颗粒定位于细胞质和细胞膜。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 老龄大鼠心肌组织形态结构 C组老龄大鼠心肌纤维排列结构紊乱，间隙较宽，间质较多，肥大趋势明显。经历8 w不同负荷游泳运动后，H组老龄大鼠心肌纤维出现大量断裂，发生了不同程度的运动性心肌肥大，毛细血管充血，心肌纤维横截面出现的空白面积最大，有坏死现象发生；M 组大鼠心肌纤维断裂现象明显，毛细血管偶见轻度充血，横断面空白面积较大，与H 组比较未出现明显的坏死现象；S组心肌纤维排列有序，细胞间质减少，心肌纤维肥厚，走向正常，着色比较均匀，且未观察到肌丝断裂，也无充血坏死现象发生。见图1。

2.2 不同负荷游泳运动对大鼠心肌细胞Bcl-2表达的影响 Bcl-2免疫反应阳性细胞定位在心肌细胞的胞浆和细胞质，呈棕褐色颗粒。S 组Bcl-2蛋白免疫反应阳性细胞居最高，H组最低，各组心肌细胞Bcl-2蛋白表达S组(0.24±0.05)，M组(0.14±0.03)，H组(0.07±0.04)，C组(0.13±0.02)，S组>M组>C组>H组(P<0.05，P<0.01)，见图2。

2.3 不同负荷游泳运动对大鼠心肌细胞Bax蛋白表达 Bax免疫反应阳性细胞定位在心肌细胞的胞浆和细胞质，呈棕褐色颗粒。S 组Bax蛋白免疫反应阳性细胞处最低，H组居最高，各组间心肌细胞Bax蛋白表达为S组(0.04±0.02)，M组(0.12±0.02)，H组(0.18±0.02)，C组(0.12±0.04)；H组>C组>M组>S组(P<0.05,P<0.01)。见图3。

图1 心肌细胞HE染色图(×200)

图2 Bcl-2免疫组化样本阳性细胞表达图(×200，箭头所指处)

图3 Bax免疫组化样本表达图(×200，箭头所指处)

3 讨 论

张昊等〔4〕在研究老龄大鼠运动训练对心脏影响的研究功能中，老年运动组大鼠心肌超微结构观察可见结构清晰，线粒体数目增多，基质致密，脂褐素颗粒成绩显著减少。余冬敏〔5〕研究力竭游泳应激导致大鼠心肌损伤的实验得出：长期力竭游泳应激会使心脏产生一系列病理及功能的改变,造成运动性心脏超负荷,破坏心肌局部组织结构,最终导致心肌损伤。郭勇力等〔6〕研究发现：中等负荷组大鼠心肌组织无细胞坏死现象发生，心肌结构清晰且排列有序，心肌纤维组织与细胞核均未见异常，但力竭训练组的大鼠心肌纤维受到不同程度的损伤，心肌组织横纹呈现模糊或有的消失不见，细胞核出现破裂或溶解现象，且周边区伴有充血状。综合以上学者研究结果，虽然不同运动负荷及运动时间不一，但适宜的运动负荷运动对大鼠心脏最有利的观点并不相悖。

王艳艳等〔7〕研究藏红花酸预处理对心肌缺血大鼠的心肌细胞保护作用机制发现可能与Bcl-2蛋白表达增多，Bax蛋白表达下降有关。李文娟〔8〕在抗阻练习对大鼠骨骼肌细胞凋亡影响的研究中显示，大鼠进行10 w抗组训练后促使D-半乳糖模型SD大鼠腓肠肌Bcl-2、Bax蛋白表达明显减少;潘月顺等〔9〕研究结果显示：低强度运动负荷可促进Bcl-2表达，而中等强度运动负荷抑制Bax蛋白表达量，同时提高Bcl-2蛋白表达量，进而降低CHF大鼠心肌细胞的凋亡率；而高强度运动负荷心肌细胞Bax蛋白表达量显著提高，进而使CHF大鼠心肌细胞凋亡率升高;陈淦等〔10〕研究表明：安静对照组、中等和大强度运动组均有Bcl-2表达，中等强度运动组和安静对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),大强度运动组和安静对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),大强度运动组表达显著低于中等强度运动组(P<0.05)。适宜运动可抑制心肌细胞Bax蛋白表达，同时促进Bcl-2表达升高，优化Bcl-2/Bax比值，有效控制凋亡现象发生，保证心肌细胞生存能力，达到延缓心肌细胞衰老的效果。大量研究均证明：超负荷或力竭性运动都可加速心肌细胞凋亡发生〔11〕,不适宜的运动负荷会造成大鼠心肌细胞凋亡增加,并且可能参与心肌的损害过程。

本实验研究结果表明，适宜的游泳运动促进Bcl-2表达增加，Bax蛋白表达降低，进而抑制心肌细胞凋亡发生；大负荷运动利于Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白的表达升高，进而促进心肌细胞凋亡的发生。提示Bcl-2、Bax 蛋白表达变化是运动干预心肌细胞凋亡的调控机制之一，与上述观点并不相悖。

1 Oltvai ZH，Milliman CL,Korsmeyer SJ,etal.BCL-2 hetero dimerizs in vivo with a conserved homolog Bax，that accelerates program med cell death〔J〕.Cell，1993;74(4):609-19.

2 李明学,程珂玲.有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(4):950-2.

3 刘忠民，刘慧佳，宋 燕，等.不同运动负荷对大鼠海马神经c-fos表达的影响〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(6)：963-4.

4 张 昊，王伟伟，薛 过，等.运动训练通过诱导自噬、抑制凋亡改善老龄大鼠心脏功能〔J〕.中国病理生理杂志，2014;30(1)：11-7.

5 余冬敏.力竭游泳应激致大鼠心肌损伤的实验研究〔D〕.广州：南方医科大学硕士论文，2014(2):38-9.

6 郭勇力，刘 霞，张文锋，等.不同强度运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响〔J〕.中国临床康复，2004;8(9):1732-3.

7 王艳艳，孙经武，樊维娜，等.藏红花酸预处理对心肌缺血大鼠凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax表达影响〔J〕.临床心血管病杂志，2015;3(1)：93-6.

8 李文娟.抗阻练习对衰老大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响〔D〕.上海：华东师范大学硕士论文，2008.

9 潘月顺，仇 琪.不同负荷运动对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响〔J〕.中国运动医学杂志，2014;32(12):1082-7.

10 陈 淦,汤长发.不同强度运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响〔J〕.生命科学研究,2012;16(2)：102-7.

11 张鹤亭.不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响〔D〕.武汉：武汉体育学院，2008.

〔2016-01-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省科技厅自然科学基金项目(201215037)；吉林省发改委产业技术研究与开发项目(No.2013C011)；吉林市科技局专项研究项目(No.2015313013)

刘忠民(1960-)，男，教授，主要从事运动与健康科学研究。

王永良(1988-)，男，硕士，主要从事运动人体科学研究。

G804

A

1005-9202(2017)08-1857-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.015

1 长春公安医院 2 日本早稻田大学体育科学研究科