鸦胆子油逆转奥沙利铂耐药胃癌SGC-7901细胞对奥沙利铂的敏感性

杨 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肃省人民医院消化科，甘肃 兰州 730000)

鸦胆子油逆转奥沙利铂耐药胃癌SGC-7901细胞对奥沙利铂的敏感性

杨 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肃省人民医院消化科，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨鸦胆子油增加奥沙利铂(OXA)耐药胃癌SGC-7901细胞(SGC-7901/COXA)对OXA敏感性的效果。方法 (1)建立SGC-7901/COXA细胞株。首先通过让细胞持续接触药物的培养方法，并逐渐增加OXA的浓度，建立SGC-7901/COXA细胞株。(2)计算鸦胆子油及OXA对SGC-7901/COXA细胞增殖抑制率及药物的IC50。取对数生长期SGC-7901/COXA细胞，培养24 h，然后加入不同浓度的鸦胆子油、OXA，继续培养48 h后应用CCK8试剂测定各孔光吸收值(A)，取平均值，计算两药单独对SGC-7901/CDDP细胞增殖抑制率及药物的IC50。(3)计算两药联合后SGC-7901/COXA细胞增殖抑制率、IC50逆转倍数。选择适宜的鸦胆子油浓度与不同浓度OXA联合，重复CCK8法，计算两药联合后SGC-7901/COXA细胞增殖抑制率、IC50、逆转倍数。结果 鸦胆子油、OXA对SGC-7901/COXA细胞增殖具有抑制作用，该作用与浓度呈正相关。鸦胆子油、OXA对SGC-7901/COXA细胞的IC50分别为91.39 μg/ml和5.37 μg/ml。鸦胆子油联合不同浓度OXA后对SGC-7901/COXA细胞增殖抑制作用明显增强，联合用药后OXA的IC50降为1.29，逆转耐药倍数为4.16，因此SGC-7901/COXA对OXA敏感性明显增强。结论 鸦胆子油与OXA联合后SGC-7901/COXA对OXA的敏感性增加，相对单独使用易产生耐药性的缺点，两者联合后能有效提高SGC-7901/COXA对OXA的敏感性。

奥沙利铂；胃癌；SGC-7901细胞；鸦胆子油

胃癌治疗方案以手术切除为主，但因多数胃癌患者发现时已属晚期，失去根治性手术治疗机会。因此只能选择以化学治疗为主的综合治疗方案。回顾化疗药物的发展，从早期的氟尿嘧啶+阿霉素，到新一类以铂类为主的化疗方案，有效率亦仅有40%，难以进一步提高。而制约化疗效果的一个关键因素是药物的耐药性，这是化疗的瓶颈。中药在化疗减毒增效方面发挥重要作用。鸦胆子油是从鸦胆子果实中提纯得到的脂肪油，具有抗肿瘤作用，而且与化疗药物合用具有减毒增效的作用，同时具有一定逆转化疗药物耐药作用(多药耐药逆转和拓扑异构酶Ⅱ抑制作用)。本研究进一步验证鸦胆子油能否增加SGC-7901/COXA对奥沙利铂(OXA)敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SGC-7901细胞(ATCC)；OXA(江苏豪森)；鸦胆子油(沈阳药大雷允上公司)；胆囊收缩素八肽(CCK8)试剂盒(日本同仁)；酶标仪(奥地利帝肯公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立SGC-7901/COXA细胞株 本研究采用大剂量间隙冲击逐步增加剂量法建立SGC-7901/COXA细胞株。首先取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞，用 0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液后，接种于25 cm2培养瓶中，根据预实验的结果，应用含有0.125 μg/ml OXA(相当于抑制率为20%浓度)的RPMI 1640培养液培养，经过多次传代，观察细胞生长稳定无明显变形，可增加药物浓度，经过3个月的诱导，使胃癌SGC-7901细胞依次能在0.25、0.5、1、2 μg/ml RPMI 1640培养液中稳定生长和传代，建立其耐药细胞株。实验观察到耐药细胞株增殖速度减慢，倍增时间延长。

1.2.2 应用CCK8法观察鸦胆子油、OXA及两药联合后SGC-7901/COXA细胞增殖抑制率、药物的IC50、逆转倍数。

取对数生长期的SGC-7901/COXA细胞，应用0.25%胰酶消化，制成2×104/ml单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μl，其中1孔留作空白孔，然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，使得细胞充分贴壁。然后将细胞从培养箱中取出，加入不同浓度的鸦胆子油和OXA，鸦胆子油各组终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，OXA各组终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml，阴性对照组每孔加入100 μl RPMI 1640培养液，空白孔加200 μl普通培养液(不加细胞)，每个浓度组设6个复孔。加药后将细胞再次置于培养箱中继续培养48 h。然后按照每孔加入20 μl CCK8试剂，继续培养2 h，即可用酶标仪测定各孔OD值，波长取490 nm。取6个复孔的平均值。计算药物作用48 h的增殖抑制率。抑制率=〔1-(实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(阴性对照组平均OD值-空白组平均OD值)〕×100%。根据抑制率计算两药的IC50，然后选择适宜的鸦胆子油与OXA联合作用于SGC-7901/COXA细胞，重复CCK8方法，计算两药联合后细胞增殖抑制率及逆转倍数。

2 结 果

2.1 建立SGC-7901/COXA细胞株 根据预实验及正式实验结果，观察到OXA对胃癌SGC-7901细胞的IC50为0.84 μg/ml，而OXA对SGC-7901/COXA细胞IC50为5.37 μg/ml，耐药倍数为6.39。因此通过大剂量间隙冲击逐步增加剂量法建立SGC-7901/COXA细胞株这种方法可行。

2.2 鸦胆子油、OXA及两药联合后SGC-7901/COXA细胞增殖抑制率、药物的IC50、逆转倍数 根据鸦胆子油对SGC-7901/COXA细胞的增殖抑制作用结果，选择浓度为30 μg/ml鸦胆子油(相当于IC30浓度)与不同浓度OXA联合作用于SGC-7901/COXA细胞。鸦胆子油、OXA及两者联合对SGC-7901/COXA细胞增殖具有不同程度的抑制作用，并且抑制作用强度与浓度呈正相关。48 h鸦胆子油6.25 μg/ml抑制率(10.2±1.5)%,12.5 μg/ml抑制率(15.4±1.9)%,25 μg/ml抑制率(22.2±2.1)%,50 μg/ml抑制率(35.7±4.0)%,100 μg/ml抑制率(55.3±5.3)%；OXA 0.125 μg/ml抑制率(5.3±0.6)%,0.25 μg/ml抑制率(8.3±1.1)%,0.5 μg/ml抑制率(12.4±1.7)%,1 μg/ml抑制率(20.1±2.2)%,2 μg/ml抑制率(33.7±3.6)%；鸦胆子油+OXA 0.125 μg/ml抑制率(8.2±1.0)%,0.25 μg/ml抑制率(12.3±1.6)%,0.5 μg/ml抑制率(22.4±2.5)%,1 μg/ml抑制率(40.3±4.7)%,2 μg/ml抑制率(66.5±6.4)%。鸦胆子油联合OXA后对SGC-7901/COXA细胞较单用OXA增殖抑制作用明显增强，联合用药后OXA的IC50为1.29，逆转耐药倍数为4.16，因此SGC-7901/COXA细胞对OXA敏感性明显增强。见图1。

图1 OXA单用与联合鸦胆子油对SGC-7901/COXA 细胞增殖抑制对比

3 讨 论

早期胃癌以手术切除治疗为主，晚期胃癌以化疗为主，目的主要在于提高患者生活质量及延长生存时间。OXA为第三代铂类抗癌药物，具有抗癌谱广，溶解性和稳定性良好等优点，因此疗效确切显著，作为晚期胃癌标准治疗方案〔1〕。国外一些关于OXA联合化疗方案研究结果表明，含OXA组患者总生存时间、有效率较顺铂组高，总生存时间10.7个月、有效率为41.3%，且血液、胃肠、肾毒性等不良反应发生率低〔2，3〕。铂类药物抗肿瘤作用机制为药物进入细胞后，首先水解成化合物，然后进一步去质子化，生成羟基化的配位离子，与DNA链间或链内交联，因此DNA 结构发生改变，导致DNA 转录复制终止，诱导肿瘤细胞凋亡和阻滞细胞周期，从而达到抗癌目的〔4〕。而铂类药物在发挥抗肿瘤作用的同时，也会激活体内一些其他的信号通过，这是其产生毒性不良反应和耐药的原因〔5〕。

肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性的主要作用机制：(1)细胞内药物有效浓度下降。药物泵出增加、摄取减少及药物失活都可引起细胞内药物有效浓度下降。OXA在体内代谢主要依赖于谷胱甘肽转移酶(GST)。GST不但具有解毒功能，还可促进DNA损伤的修复，因此可导致细胞耐药发生。另外GST家族中人体肿瘤组织中存在大量的GSTP1，其作为GST家族中一员，可催化细胞内大量如谷胱甘肽(GSH)、金属硫蛋白等巯基分子，这些物质与铂类药物共价结合后，使铂类药物停留在细胞质，不能进入细胞核内与DNA 发生交联，使DNA产生损伤。另外还可增强铂类药物水溶性，使药物排出增加，细胞内药物有效浓度降低，药物抗肿瘤活性减弱。(2)DNA损伤修复作用增强。因DNA 损伤修复在一定程度上可以削弱铂类药物诱导细胞凋亡作用。OXA在体内产生耐药及敏感性降低主要与切除修复互补交叉基因(ERCC1)、ERCC2、ERCC5等核苷酸切除修复因子有关〔6〕。其中ERCC1 在NER 系统中具有DNA损伤修复和核酸内切酶的双重功能，因此通过提高ERCC1 表达水平可以快速修复G2/M期的DNA 损伤，引起细胞对OXA耐药反应。而ERCC2 则具有多个单核苷酸多态性，其介导751 位密码子由Lys 转变为Gln，影响OXA的治疗效果。而ERCC5 作为一种结构特异性核酸酶，存在于多种肿瘤组织，其表达强弱与OXA药物敏感性相关。(3)介导细胞凋亡信号转导途径异常〔7〕。若转导途径被异常激活或者被抑制，细胞就会对铂类药物产生抵抗及诱导细胞凋亡作用减弱。这些过程参与蛋白主要包括p53和Bcl-2家族蛋白〔8〕。另外，分泌型聚集素(sCLU)蛋白与OXA耐药有关。sCLU可激活AKt 通路引起细胞对OXA耐药反应，其表达水平与OXA介导癌细胞凋亡呈负相关〔9〕。

鸦胆子属苦木科植物，从其干燥的成熟果实中可提取出脂肪油即鸦胆子油。鸦胆子油对多种癌症的治疗通过抑制拓扑异构酶的活性，进一步抑制细胞DNA 的复制、转录、重组，阻断癌细胞从G0/G1期细胞发展到S期；上调caspase信号通路周期相关蛋白p53，达到抑制癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的目的。鸦胆子油还可以破坏细胞质膜系统、线粒体系统、粗面内质网细胞器等发挥直接杀伤癌细胞作用〔10〕。诸多研究提示鸦胆子油与化疗药物联合应用，可提高治疗效果，同时降低恶心呕吐等不良反应的发生，并能减少化疗药物导致出现的骨髓抑制、血常规下降等副反应〔11〕。耿国军等〔12〕通过鸦胆子油作用到肺腺癌细胞SPA-A1后观察结果，肺腺癌细胞呈凋亡形态学改变，将肺癌腺细胞(SPA-A1)阻滞于G0/G1期；抑制肺腺癌SPA-A1细胞增殖，诱导细胞凋亡。魏红斌〔13〕通过对325例胃癌患者进行meta分析，结果发现鸦胆子油联合化疗方案对胃癌患者进行治疗后，能提高胃癌患者疗效，生活质量得以改善，化疗药物副作用减轻。杨凡等〔14〕研究认为鸦胆子油联合化疗能提高结肠癌患者化疗效果，同时减轻化疗的副反应，具有增效减毒作用。有研究发现，OXA可影响钠、钙离子交换通道，从而引起神经毒性的发生〔15〕。相关实验研究发现鸦胆子油对多药耐药具有逆转作用，并能明显抑制ONA拓扑异构酶(TOPO)Ⅱ的活性。汤涛等〔16〕进行体外肿瘤细胞增殖生长抑制实验研究发现，鸦胆子油乳浓度为0.025 g/L时能在一定程度上逆转K562/A02、MCF-7/ADM 和KB/VCR 等细胞的耐药性。同时鸦胆子油能抑制由TOPOⅡ介导的κDNA 去连环作用，浓度为0.31 g/L时部分抑制TOPOⅡ酶活力，浓度为2.5 g/L可完全抑制ONA拓扑异构酶TOPOⅡ酶活力。所以当鸦胆子油与其他抗癌药联合应用时，鸦胆子油可发挥其耐药逆转作用，增强其他药物对耐药细胞的细胞毒作用。

本实验从体外实验进一步验证了鸦胆子油联合OXA临床减毒增效作用，下一步将研究鸦胆子油逆转OXA耐药胃癌SGC-7901细胞对OXA敏感性的具体机制。

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〔2016-12-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

魏小果(1973-)，女，副主任医师，主要从事消化系统肿瘤研究。 石玉萍(1966-)，女，主任医师，主要从事消化系统肿瘤研究。

杨 帆(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事消化系统肿瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)08-1854-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.014