苦参总碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

樊美玲 刘 博 王 鑫 温富春 丁 涛 纪凤兰 徐惠波

(吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012)

苦参总碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

樊美玲 刘 博 王 鑫 温富春 丁 涛 纪凤兰 徐惠波

(吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012)

目的 利用心肌缺血再灌注损伤致大鼠心肌细胞凋亡模型研究苦参总碱(TASF)对心肌细胞的保护作用。方法 80只雄性大鼠随机分组，连续给药7 d，末次给药1 h后除空白组动物外，其余动物结扎左冠脉前降支30 min，再灌注6 h，通过血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门天冬氨酸氨基转移酶(AST)，心肌病理学、电镜、TUNEL染色及Bcl-2、Bax蛋白表达的检测对TASF保护心肌的作用进行评估。结果 与模型组相比，80 mg/kg TASF能够有效降低血清中CK、LDH、AST的含量(P<0.05)，40 mg/kg TASF能够有效降低血清中LDH、AST的含量(P<0.05)；80 mg/kg和40 mg/kg TASF能够减少缺血再灌注导致的心肌细胞结构的破坏；80 mg/kg TASF可以减少缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡(P<0.05)，其机制可能与增加Bcl-2蛋白的表达，降低Bax蛋白表达有关。结论 TASF对心肌缺血再灌注引起的心肌细胞损伤具有保护作用，其机制可能为调控Bcl-2、Bax基因表达抑制心肌细胞凋亡。

苦参总碱；缺血再灌注损伤；凋亡；心肌保护

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)可通过氧自由基损伤、钙超载等多种机制对心肌细胞造成损伤，同时在此过程中，均可以引起较为严重的心律失常。苦参总碱(TASF)是苦参的主要活性成分之一，其药理活性主要为抗心律失常、抗病毒，抗肿瘤等。心律宁片是TASF的中成药制品，临床上主要用于抗各种原因引起的心律失常的治疗，对于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有较好的疗效〔1〕，但对于缺血再灌注过程中心肌保护等作用报道较少。本实验通过大鼠心肌缺血再灌注致心肌细胞凋亡模型观察TASF对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠，80只，体重300～350 g，购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2011-0004，动物许可证号：201500009838，201500009913，201500009998，2015000010032，201500010077，201500010697；饲养环境设施合格证：SYXK(吉)2015-0009。

1.2 药品 心律宁片，酒泉大得利制药有限公司生产，批号：150404。地奥心血康胶囊，成都地奥制药集团有限公司生产，批号：1501065。

1.3 主要试剂与仪器 乌来糖，国药集团化学试剂有限公司生产，批号：T20100310；肌酸激酶(CK，批号：150891)、乳酸脱氢酶(LDH，批号：160581)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST，批号：151221)测定试剂盒，均为中生北控生物科技股份有限公司生产；Bcl-2(N-19，货号：sc-492，批号：G1315)、Bax (B-9，货号：sc-7480，批号：H1215)、山羊抗兔IgG-HRP，山羊抗鼠(货号：sc-2004，批号：F2215)、山羊抗鼠IgG-HRP(货号：sc-2005，批号：H0415)；均为Santa Cruz Biotechnology Inc生产；In Situ Cell Death Detection Kit，Roche公司生产，批号：10768100。PowerLab/8S型多导生物记录仪，AD Instruments公司生产；IMS-40型雪花形制冰机，常熟市雪科电器有限公司生产；ELx800酶标仪，BioTek Instruments,Inc生产；DYY-6C六一电泳仪，北京市六一仪器厂生产；GF-D800型半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司生产；RM2255型高精密全自动切片机，德国徕卡。

1.4 实验方法 雄性Wistar大鼠80只(每组10只)，随机分为空白组、MIRI模型组、地奥心血康组(120 mg/kg)、80 mg/kg TASF组、40 mg/kg TASF组、20 mg/kg TASF组。连续给药7 d，末次给药1 h后，乌来糖1.2 g/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，切开气管接人工呼吸机供开胸后进行人工呼吸，连接八道生理记录仪连续观察和记录心电图。在胸左侧第四五肋间处切开胸壁并沿胸骨左缘2 mm处切断第四和第五肋骨，用拉钩挤出心脏，从左心耳下方2 mm处进针，斜穿过左冠状动脉前降支下心肌，从肺动脉圆锥左缘出针，然后将心脏还回胸腔中，待恢复10～20 min，T波恢复后，将直径2 mm、长4 cm的塑料管与左冠状动脉前降支平行放置，用穿过冠状动脉的丝线将冠状动脉和塑料管一起接扎，造成心肌缺血，以ECGⅡ导联ST段明显提高作为结扎成功的标志。心肌缺血30 min后剪断结扎线，取下塑料管，恢复冠状动脉血流6 h。空白组开胸穿线，不结扎左冠状动脉，整个试验过程中连续记录Ⅱ导联心电图。实验结束后腹主动脉采血，离心分离血清-80℃保存，进行CK、LDH、AST等心肌酶的检测；取心脏，心尖用2.5%的戊二醛溶液固定进行电镜检测，其余心脏分为两份，一份10%甲醛溶液固定做病理检查光镜一般病理学和TUNEL染色，另一份液氮保存Western印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 TASF对MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量的影响 与空白组相比，模型组动物血清中的CK、LDH、AST含量显著升高(P<0.001，P<0.01)。与模型组相比，地奥心血康120 mg/kg能够降低MIRI大鼠血清CK的含量(P<0.01)；80 mg/kg TASF能够降低血清中的CK、LDH、AST含量(均P<0.05)；40 mg/kg TASF能够降低血清中的LDH、AST含量(均P<0.05)。见表1。

2.2 TASF对MIRI大鼠心肌组织一般病理学的影响 空白组心脏组织结构正常，结构清晰，未见纤维结缔组织增生，未发现异常，未见炎细胞浸润。模型组心脏可见心肌纤维间质水肿，心肌间质疏松，少量局部心肌间质内可见淋巴细胞为主的炎细胞浸润。局部心肌可见肌凝、肌溶解，心肌坏死，心肌间质内可见炎细胞浸润，心肌间质出血。地奥心血康组内心肌细胞间质内出血减少，心肌细胞局部染色不均。80 mg/kg TASF组心肌细胞间质出血减少，少见炎细胞浸润，效果优于地奥心血康组。40 mg/kg TASF组心肌细胞少见染色不均，总体效果与之相似。20 mg/kg TASF组心肌细胞可见心肌细胞坏死，心肌可见多处染色不均，可见轻微炎细胞渗出，间质出血，显示TASF各组病理结果表现优于模型组。见图1。

2.3 TASF对MIRI大鼠心肌细胞结构的影响 在电镜下观察，空白组心肌细胞排列整齐，闰盘正常，肌丝束，肌节结构清晰，线粒体纵行排列在肌丝束之间。与空白组相比，模型组的心肌细胞呈高度不规则形，周围肌丝大部分消失，肌节结构不清；线粒体增生肿胀，空化严重。可见模型组的心肌细胞结构损伤比较严重。地奥心血康组心肌细胞肌节明暗带清晰，局部线粒体增多，致密，个别线粒体嵴断裂，基质空化，并有脂滴夹杂在肌丝中。 80 mg/kg TASF组肌丝束上肌节结构清晰，局部线粒体增多且致密，表现与地奥心血康组类似。40 mg/kg TASF组肌丝束排列整齐，肌节结构清晰可辨，线粒体结构和数量正常，表现较为接近空白组。20 mg/kg TASF组肌丝束排列紊乱、断裂，肌小节结构不清，明带消失，Z线增粗，线粒体大量增生，肿胀，空化严重，表现类似于模型组。见图2。

表1 TASF对MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量及心肌细胞凋亡的影响

与空白组比较：1)P<0.01，2)P<0.001；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

图1 TASF对MIRI大鼠心肌病理学的影响 (HE，×400)

图2 TASF对MIRI大鼠心肌细胞结构的影响(×10 000)

2.4 TASF对MIRI大鼠心肌组织细胞凋亡TUNEL染色的影响 与空白组相比，模型组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.001)。与模型组相比，120 mg/kg地奥心血康和80 mg/kg TASF能够明显降低心肌细胞凋亡率(P<0.05)。见表1，图3。

图3 TASF对MIRI大鼠心肌细胞凋亡的 影响 (TUNEL，×400)

2.5 TASF对MIRI大鼠心肌组织Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与空白组相比，模型组的Bcl-2表达降低，Bax表达增加(P<0.05，P<0.01)。与模型组相比，80 mg/kg TASF能明显增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05)。120 mg/kg 地奥心血康和40 mg/kg TASF有一定增加的趋势；120 mg/kg地奥心血康、80 mg/kg和40 mg/kg TASF组能降低心肌中Bax蛋白的表达(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。见图4，表2。

1～6:空白组、模型组、地奥心血康组、80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg TASF组图4 TASF对MIRI大鼠心肌组织Bcl-2和Bax表达的影响表2 TASF对MIRI大鼠心肌组织Bcl-2和 Bax表达相对灰度的影响

组别Bcl-2Bax空白组100.0±0.00100.0±0.00模型组75.0±11.191)131.8±5.902)地奥心血康组97.1±18.44102.9±7.084)80mg/kgTASF组127.4±26.263)101.9±4.754)40mg/kgTASF组117.3±28.84110.2±13.733)20mg/kgTASF组110.2±32.30130.6±21.10

3 讨 论

急性心肌缺血是冠心病的主要病理生理表现，表现为心肌组织、器官供血中断，一定时间内再恢复血供，缺血组织、器官不仅功能没有恢复，反而使功能障碍和结构损伤进一步加重。MIRI是急性心肌梗死后再灌注治疗中常出现的病理过程，目前认为其造成心肌损伤的机制主要是能量代谢障碍、活性氧增加，钙超载等引起心肌细胞功能和结构的障碍最终影响心脏的泵血功能〔2,3〕。此外，在心肌缺血和再灌注的过程中，可引起心脏电生理活动的异常，导致严重的心律失常，是冠心病患者死亡的主要原因之一。

TASF是中药苦参的主要活性成分之一，目前已分离出的生物碱多达20多种，其中具有药理活性的主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐胺碱、槐定碱。其主要的药用活性成分苦参碱及氧化苦参碱均有抗心律失常的作用，且具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。TASF目前已被开发成多种剂型的中成药并在临床上用于抗心律失常、抗肿瘤、抗炎的治疗。心律宁片是TASF的中成药制品，临床上主要用于抗各种原因引起的心律失常的治疗，对于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有较好的疗效，但对于缺血再灌注过程中心肌保护等作用报道较少。CK、LDH和AST是反映心肌细胞损伤的一般性指标，本研究结果显示TASF具有在MIRI中保护心肌细胞的作用。通过光镜观察心肌的大体结构及电镜直接观察心肌细胞的超微结构也提供了TASF保护心肌细胞的证据。凋亡是多基因严格控制的过程，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。目前认为其与多种基因表达有关，如Bcl-2家族、caspase家族等〔4～8〕。MIRI与细胞凋亡也有着密切的关系，MIRI过程中可导致Fas/FasL系统、抑癌基因P53、MAPK、PI3K/PKB、JAK/STAT等多种信号通路的异常，启动心肌细胞凋亡的级联反应，引起心肌细胞凋亡〔9〕。大量心肌细胞凋亡最终导致心功能障碍。Bcl-2和Bax是目前比较公认的一对调控凋亡的基因，Bcl-2的表达抑制凋亡，而Bax表达则促进细胞凋亡〔10〕。本研究结果显示，TASF能够增加MIRI动物模型心肌中Bcl-2蛋白的表达，并抑制Bax蛋白的表达，提示其抑制心肌细胞凋亡可能与调控Bcl-2和Bax基因的表达有关。

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〔2016-12-31修回〕

(编辑 曹梦园)

吉林省科技发展计划项目(20140522040JH)

徐惠波(1963-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事心脑血管药理研究。

樊美玲(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事中医内科基础与临床研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1840-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.008