甲状腺激素受体基因与卵巢癌顺铂耐药关系的研究*

李君，刘恩令

（河北医科大学附属唐山市工人医院 妇产科，河北 唐山 063000）

甲状腺激素受体基因与卵巢癌顺铂耐药关系的研究*

李君，刘恩令

（河北医科大学附属唐山市工人医院 妇产科，河北 唐山 063000）

目的 探讨甲状腺激素受体基因（THRB）是否为耐药相关基因或影响卵巢癌细胞耐药。方法合成特异性基因探针，利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术显示细胞在激素作用下的基因表达差异。结果THRB的表达在人卵巢癌耐顺铂SKOV3/DDP细胞中的表达量高于非耐药卵巢癌SKOV3细胞。结论甲状腺激素能促进人卵巢癌SKOV3细胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐顺铂细胞的增殖，THRB在卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞中的表达的量远高于一般卵巢癌SKOV3细胞，THRB对卵巢癌耐药起着非常重要的作用，可能是耐药相关基因，其机制有必要进一步探讨。

甲状腺激素受体；卵巢癌；顺铂耐药

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率占第3位，而死亡率居第1位。导致卵巢癌5年生存率不高的一个主要原因是肿瘤细胞对化疗药物发生耐药性[1]。卵巢癌化疗耐药不光是当前研究的热门，亦是卵巢癌治疗走出瓶颈的关键。激素是人体组织细胞的重要调节物质，在肿瘤细胞中，激素对其分裂、成形、迁移及凋亡均有重要调节作用，尤其在恶性肿瘤细胞中激素及激素受体基因的表达常常处于非正常状态。为探讨相关激素在卵巢癌细胞中是否与铂类耐药相关，本研究选择了甲状腺激素受体基因（thyroid hormone receptor，THRB）作为研究对象，分析其在卵巢癌耐药细胞株（SKOV-3/DDP）的表达及功能，探讨其与卵巢癌铂类耐药的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞株及其培养

人卵巢癌细胞SKOV-3和人卵巢癌耐顺铂细胞SKOV-3/DDP购自中国医学科学院细胞室。培养条件：温度：37℃；气相：5%二氧化碳CO2；空气，95%；优质胎牛血清，10%；McCOY's 5A（100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素）90%。

1.2 激素作用

选择对数生长期的细胞，经胰酶消化后，用含10%FBS的McCOY's 5A培养基（100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素）调整浓度为1.5×104个/ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl（即每孔细胞数约为3×104个），于培养箱中静置培养24 h，培养条件37℃，5%CO2，弃上清。SKOV3激素协同处理组分别加入甲状腺素，激素含量为lμg/ml的无血清培养液；SKOV3/DDP激素协同处理组分别加入甲状腺素，激素含量为lμg/ml的无血清培养液；对照组为不含激素的无血清培养液；空白组为不含细胞无血清培养液，每孔均为200μl。每组10个重复孔,37℃，5%CO2培养箱中继续培养24和48 h，倒置显微镜下观察。

1.3 特异性探针制备

根据NCBI收录的基因序列，制备THRB激素类基因的特异性生物素标记基因探针。运用Primer 5.0设计特异性引物，正向引物：CTGAGTTGAAGGA AATGC；反向引物：AGGAGCTTGAGGATCTAA。使得扩增产物在500～800 bp，另外再设计特异性探针：FAM-AAGCGTCCTCCAGCCATCA-BHQ1。使得探针能够与扩增产物匹配，同时使用生物信息学软件对引物及探针进行同源性检验，排除假阳性扩增以及荧光。

1.4 细胞总RNA的提取

Trizoi法按照试剂盒说明书进行细胞总RNA的提取。

1.5 TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应

设计特异性引物和荧光探针（TaqMan探针），先用随机引物RNA逆转录成cDNA，然后进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase，qRT-PCR）。TaqMan探针是寡核苷酸探针，其被设计成靶向正反向引物配对的引物序列。荧光探针连接5'末端和3'末端的猝灭剂。完全匹配的探针与靶序列荧光团所发出的荧光3'末端和猝灭剂被接近淬灭，但延长反应过程中，qTaq DNA聚合酶的5'探针杀灭核酸外切酶的活性，使荧光团和淬灭剂分离，检测到的荧光强度不断增加，扩增循环数，释放的荧光团不断积累，荧光强度与扩增产物的数目成正比。

1.6 MTT法测定细胞存活力

SKOV3/DDP及SKOV3均在1640培养液中继续培养，待悬浮生长至对数生长期时，调整细胞浓度至4×103个/ml混匀后加进96孔板中，每孔100μl，每组共计10孔，于37℃、5%CO2培养箱培养；实验组分别加入含有浓度为10、100和1 000 ng/ml的甲状腺素和2.5μg/ml的顺铂无血清培养液；对照组为不含激素的无血清培养液，在第24、48和72 h，采用MTT法检测各组细胞的OD值，计算增殖抑制率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，每个实验重复3次，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，使用t检验检测用药组与对照组之间mRNA表达差异及甲状腺激素作用前后细胞的增殖情况。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP细胞形态比较

倒置显微镜下观察：SKOV3、SKOV3/DDP细胞均贴壁生长，SKOV3细胞多呈圆形，上皮细胞样，有少量长棍形、多边形，能看见细胞核，边界清楚，折光性好。SKOV3/DDP细胞较SKOV3细胞大呈多角形，神经元细胞样，体积膨胀，核仁多，细胞质可见颗粒状囊泡，边界模糊，折光性差。

SKOV3细胞生长到对数生长期所用时间为4 d，SKOV3/DDP细胞生长到对数生长期所用时间为6 d。甲状腺激素协同作用对SKOV3及SKOV3/DDP细胞的生长均有明显促进作用，倒置显微镜下观察：2种细胞均在作用48 h后到达对数生长期。激素处理的细胞液出现了不同程度的变化，卵巢癌耐顺铂细胞的培养液颜色变浅速度加快，原来3 d换液1次，激素处理后达到2 d换液1次，卵巢癌细胞培养液换液时间也比对照组提前，但与卵巢癌细胞相当。见图1。

2.2 设计的基因探针及引物

根据 Gen Bank数据库THRB（批准号：NM001252634）和内参照基因β-actin（ACTB批准号：NM001101)，应用Primer Express 5.0设计各基因正反向引物和探针，并应用BLAST引擎对设计的每条引物进行特异性分析，确保基因库人类已知的其他基因与每条引物比对无高度同源性。根据滤波器的波长定量PCR仪，TaqMan荧光探针荧光作为荧光报告基因，BHQ1为猝灭基因。引物和探针均由上海生物工程股份有限公司合成。

2.3 THRB在人卵巢癌SKOV-3细胞与耐顺铂SKOV-3/DDP细胞中的表达

qRT-PCR反应液采用大连宝生物工程股份有限公司的Premix Ex Taq试剂盒，引物和探针由上海生物工程股份有限公司合成。循环参数：95℃1min，1个循环；95℃10 s，60℃30 s，40个循环，每个循环后检测荧光。结果如下图所示，THRB激素受体基因在耐顺铂SKOV-3/DDP细胞及其人卵巢癌SKOV-3细胞中均有表达。为了明确THRB在人卵巢癌SKOV-3细胞及其耐顺铂SKOV-3/DDP细胞中表达有无差异，本实验提取了激素干预后人卵巢癌SKOV-3细胞及其耐顺铂SKOV-3/DDP细胞中的总RNA，逆转录为cDNA后，进行THRB在人卵巢癌SKOV-3细胞与耐顺铂SKOV-3/DDP细胞的定量分析。定量分析结果见表1及图2、3：在甲状腺激素作用下，THRB表达水平均有提高，在耐顺铂SKOV3/DDP细胞中的表达水平高于其亲本细胞人卵巢癌SKOV3细胞。（t=2.2553，P=0.0436）。

2.4 甲状腺激素作用前后SKOV3和SKOV3/DDP细胞的增殖情况

甲状腺素对卵巢癌SKOV3细胞及耐顺铂SKOV3/ DDP细胞的体外生长有明显的促进作用，随着激素浓度的增加及作用时间的延长，其对细胞生长的促进作用增加。SKOV3细胞在不同浓度激素作用24、48和72 h作用后，其细胞增殖情况采用重复测量方差进行分析，结果：①不同时间点的细胞增殖情况有差别（F=252.935，P=0.000）；②不同浓度激素作用后细胞的增殖情况有差别（F=39.372，P=0.000），激素浓度越大，细胞增殖作用越明显；③不同浓度激素作用下的细胞增殖趋势有差别（F=28.846，P=0.000）。SKOV3/DDP细胞在不同浓度激素作用24、48和72 h后细胞增殖情况采用重复测量方差分析，结果：①不同时间点的细胞增殖情况有差别（F=607.076，P=0.000）；②不同浓度激素作用后细胞的增殖情况有差别（F=57.965，P=0.000），激素浓度越大，细胞增殖作用越明显；③不同浓度激素作用下的细胞增殖趋势有差别（F=61.248，P=0.000）。见表2、图4。

表1 THRB相对初始拷贝数 （n=3，±s）

表1 THRB相对初始拷贝数 （n=3，±s）

组别THRB表达水平无激素作用48 h SKOV3 0.0449±0.0115无激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0497±0.0108 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3 0.0515±0.0127 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0938±0.0299

图1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP细胞的形态比较

图2 内参基因的扩增曲线以及标准曲线

图3 THRB的扩增曲线以及标准曲线

表2 不同浓度激素作用不同时间后各组细胞的吸光度值比较

图4 激素对卵巢癌细胞增殖的影响

3 讨论

卵巢癌起病隐匿，75%的患者确诊时已为晚期并伴有广泛转移,手术常不能完全切除，故目前最常用的治疗方案为肿瘤减灭术+以铂类为基础的药物联合化疗[2]；虽然80%患者对以铂类为基础的一线化疗方案敏感[3]，但3年内复发率却高达60%～70%以上；其中大部分患者在一线化疗后出现继发性铂类耐药,最终导致复发[4]。而铂类耐药最近研究较多，MARIYA等[5]研究表明，免疫逃逸可能是卵巢癌铂类耐药的机制之一。而大量研究证明，卵巢癌是一种激素依赖性肿瘤，一旦人体多种激素分泌失调会导致人体对细胞的正常调控作用出现失调，进而导致细胞自主增殖或凋亡减少，进而导致卵巢癌产生耐药。甲状腺激素对铂类耐药的卵巢癌细胞的影响较少，国外研究表明[6]，卵巢癌上皮组织中TSHRmRNA表达降低而蛋白表达升高,此项验研究证明卵巢癌患者甲状腺刺激素受体蛋白的转录和表达异常。顺铂是治疗卵巢癌的主要化疗药物，正是因为顺铂的出现使卵巢癌治疗出现了重大转机，使卵巢癌5年生存率有了较大改观。而一些患者在治疗一段时间后会产生耐药，这导致治疗失败，影响了预后。因此为进一步探讨顺铂耐药的机制，从而为克服耐药提供理论依据，纵多学者从多方面进行的深入研究，本研究从激素角度探讨卵巢癌铂类耐药机制，结果表明，THRB的表达在人卵巢癌耐顺铂SKOV3/DDP细胞中的表达量高于卵巢癌SKOV3细胞。因此认为甲状腺激素能促进人卵巢癌SKOV3细胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐顺铂细胞的增殖，THRB在卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞中的表达量也高于一般卵巢癌SKOV3细胞，THRB对卵巢癌耐药起着非常重要的作用，可能是耐药相关基因。

卵巢癌铂类耐药机制复杂而多样，涉及多药耐药基因及多种激素类基因。本研究为探讨激素类基因在卵巢癌铂类耐药中的作用进行了初步研究，为将来进一步探讨更深层次的机制奠定了一定的基础。

[1]BALCH C,HUANG TH,BROWN R,et al.The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004,191(5):1552-1572.

[2]MARCUS C S,MAXWELL G L,DARCY K M,et al.Current approaches and challenges in managing and monitoring treatment response in ovarian cancer[J].J Cancer,2014(5):25.

[3]KELLAND L.The resurgenceof platinum-based cancer chemotherapy[J].Nature Reviews Cancer,2007,7(8):573-584.

[4]SORRENTINO A,LIU C G,ADDARIO A,et al.Role of microRNAs in drug-resistant ovarian cancer cells[J].Gynecologic oncology,2008,111(3):478-486.

[5]MARIYA T,HIROHASHI Y,TORIGOE T,et al.Prognostic impact of human leukocyte antigen class I expression and association of platinum resistance with immunologic profiles in epithelial ovarian cancer[J].Cancer Immunol Res 2014,2(12):1220-1229.

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（张西倩 编辑）

Relationship betweenTHRBand cisp latin resistance in ovarian cancer cells*

Jun Li,En-ling Liu
(Department of Gynecology and Obstetrics,Tangshan Gongren Hospital Affiliated to HebeiMedical University,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo investigate whether thyroid hormone receptor gene(THRB)is a drug resistance related gene in ovarian cancer cells.MethodsThe specific gene probe was synthesized.RT-PCR technique was used to display the difference of gene expression under the action of thyroid hormone.ResultsThe expression ofTHRBin the human ovarian cancer SKOV3/DDP cells was significantly higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.ConclusionsThyroid hormone can promote the proliferation of human ovarian cancer SKOV3 and SKOV3/DDP cells.The expression ofTHRBin the ovarian cancer SKOV3/DDP cells ismuch higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.THRBmay play a very important role in drug-resistance of ovarian cancer and may be a drug resistance related gene,and itsmechanism is necessary to be further explored.

thyroid hormone receptor,ovarian cancer;platinum resistance

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.008

1005-8982（2017）07-0036-05

2016-11-27

河北省医学重点科技研究计划（No：1020140385）

刘恩令，E-mail：enling111@sina.com；Tel：13832828669