山腊梅几丁质酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

于国云　于鑫铭　刘晓丹

摘要：本研究利用RT-PCR技术扩增山腊梅几丁质酶基因，对几丁质酶基因的序列进行生物信息学分析，同时成功构建植物表达载体，为植物几丁质酶基因功能的研究提供理论基础。

关键词：山腊梅；几丁质酶；基因克隆；植物表达载体

中图分类号：Q344.13 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132003

几丁质酶不仅在植物抗真菌病害中起着重要的作用，而且在植物发育、生物固氮及抗逆等方面都发挥关键作用。特别是在病虫害防治方面，采用生物技术的手段改良植物的抗病虫害和抗逆的研究越来越多，且已取得了较为明显的成果。目前已先后从小拟南芥、大白菜、菜豆、野生香蕉、紫花苜蓿、中国水仙等植物中克隆获得几丁质酶基因。随着人们对其作用、特性、表达调控及转基因的深入研究，使几丁质酶基因成为植物分子生物学研究领域中重要的研究对象及作物抗真菌病害基因工程的研究热点。

鉴于几丁质酶基因在植物抗病及抗逆方面的作用，本研究以抗病虫害及抗逆性较强的山腊梅为材料，通过RT-PCR的方法首次克隆得到山腊梅中的几丁质酶基因，并对其进行生物信息学分析，进一步构建植物表达载体。研究结果丰富了植物几丁质酶基因的研究，同时为通过植物基因工程手段提高植物的抗病虫害及抗逆功能研究提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

植物材料：山腊梅种子购自源茂种业，土培至长出幼苗（约2个月），取幼嫩叶片，5mm水杨酸处理4h后立即用液氮固定，置-80℃冰箱备用。

植物表达载体：pGFPGUSPlus由吉林大学植物科学学院提供。

主要试剂：Trizol试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、PCR产物回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1山腊梅几丁质酶基因的RT-PCR扩增

根据NCBI网站上检索到腊梅几丁质酶基因（FJ749130），设计特异性引物。以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。

PCR产物进行1%凝胶电泳检测，利用产物回收试剂盒纯化目的片段。将纯化的PCR产物送至测序公司进行测序。

1.2.2 山腊梅几丁质酶基因的序列分析

对测序结果进行相关生物信息学分析，如几丁质酶基因序列同源性比对、蛋白保守域分析，进一步使用MEGA5.05软件构建系统进化树。

1.2.3 植物表达载体的构建

将含有植物表达载体的菌落扩大培养，碱裂法提取质粒载体。将纯化的PCR产物和表达载体同时用XbaI和SacI进行酶切，并用1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收酶切后的目的基因和质粒。将目的基因和酶切质粒连接，转化到感受态大肠杆菌中。对转化子进行菌液PCR检测，并对阳性转化子菌液扩大培养，碱法提取质粒，进行双酶切鉴定。

2结果与分析

2.1山腊梅几丁质酶基因的克隆

以腊梅cDNA为模板，利用RT-PCR扩增获得一条约1000bp的特异条带（图1），进一步进行测序。

2.2山腊梅几丁质酶基因序列的生物信息学分析

测序结果分析表明山腊梅几丁质酶基因全长为939bp，编码312个氨基酸。蛋白分子量为32.9KD。核酸序列同源比对结果表明，山腊梅几丁质酶基因与已公布的腊梅几丁质酶基因（FJ560717及FJ749130）的同源性高达98%，与蒺藜苜蓿Medicago trtmcatula（Y10373）、马铃薯Solanum tuberosum（NM_001288193）、水稻Oryza sativa（XM_015788082）、辣椒Capsicumannuum（FJ596176）的同源性均为75%，与紫花苜蓿Medicago sativa（AY804254）的同源性为73%，与大麦Hordeum vulgare（AK358661）的同源性为65%。

几丁质酶蛋白保守结构域分析表明（图2），其编码的肽链具有典型的糖苷水解酶19家族几丁质酶结构域，该结构域中具有3个特征性的催化位点及6个推断的几丁质结合位点；该结构域与类溶菌酶超家族基因的保守结构域类似，推测该酶兼具溶菌酶活性。

根据几丁质酶核酸序列比对的结果，在NCBI网站上检索到11种不同植物的几丁质酶基因核酸序列，采用Neighbor_joining方法构建系统进化树。结果表明（见图3），山腊梅（Chimonanthus nitens Oliv.）与腊梅（Chimonanthus praecox（Linn.）Link）聚类在同一个单源分支上，亲缘关系最近；其次是外围枝的马铃薯、菜豆、辣椒、水稻等。与野生香蕉的亲缘关系最远。

2.3植物表达载体的构建

菌液PCR驗证阳性克隆子，进一步提取阳性质粒进行双酶切验证，结果表明（如图4），山腊梅几丁质酶基因已成功插入到表达载体pGFPGUSPlus中。

3讨论

随着植物分子生物学技术的不断发展，已有越来越多的几丁质酶基因转入不同作物中。迄今为止，已对许多几丁质酶基因进行植物遗传转化，如水稻、烟草、黄瓜、香蕉、花生、番茄、玉米等。随着对植物几丁质酶基因的结构、修饰、作用机理及转基因的深入研究，对几丁质酶的生物学功能和生理作用更加了解，为进一步开发和利用几丁质酶奠定坚实的基础，几丁质酶基因转化作物的研究将更为实用化。我国对转几丁质酶基因防治真菌等病害的应用也将进入产业化，将为农作物的防病治病、增产增收做出贡献。