牛种布鲁氏菌2308参考株ΔVceC基因缺失株的构建与鉴定

李敏，史静雪，李志强，荆明龙，刘洋，陈创夫，张辉

（石河子大学动物科技学院/动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是人和牛、羊、猪等动物共患的传染病，也是国家法定检疫和扑杀被感染家畜的三大疫病（口蹄疫、布鲁氏菌病和结核病）之一[1]。近年来，该病在全球范围呈不断上升的趋势，世界200多个国家和地区中有170多个国家和地区有布病存在和流行，引起各国政府及研究机构的广泛关注。

布鲁氏菌是革兰氏阴性菌，为球杆菌或短杆菌，无鞭毛，也不形成芽孢，一般无荚膜也不产生外毒素。根据其流行病学特点、宿主偏嗜性以及基因组结构上的差异，分为 9个种，其中对陆生动物具有致病性的有7个种，即牛种布鲁氏菌（Brucella abortus）、羊种布鲁氏菌（B.melitensis）、猪种布鲁氏菌（B.suis）、绵羊附睾种布鲁氏菌（B.ovis）、犬种布鲁氏菌（B.canis）、沙林鼠种布鲁氏菌（B.neotomae）和田鼠种布鲁氏菌（B.microti）。对海洋动物具有致病性的有 2个布鲁氏菌种，即鲸型布鲁氏菌（B.ceti）和鳍型布鲁氏菌（B.pinnipedialis）[2]。毒力相关因子主要是脂多糖、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系统、Bvr R/Bvr S双组分系统、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等应激反应蛋白，以及密度感应系统等[3]。布鲁氏菌的 T4SS对其逃避免疫监视和持续性感染发挥重要作用[4]，IV型分泌系统能分泌复杂的效应因子(类似于核蛋白复合体或蛋白质类)来干预宿主细胞的功能。

为了更好的研究T4SS效应蛋白的功能，本研究以牛种布鲁氏2308为亲本株，运用同源重组的方法，针对IV型分泌系统的 VceC基因，构建 2308-△VceC基因缺失突变株，旨在进一步研究IV型分泌系统分泌蛋白，为探索布鲁氏菌IV型分泌系统功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌DH5α、牛种布鲁氏菌由本实验室保存，PMD19-T（sample）载体购自 TaKaRa公司，PUC19K 载体由北京军事医学科学院馈赠。

1.1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶、DNA Marker均购自TaKaRa；快速琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提取试剂盒、dNTP均购自天根生化科技有限公司；琼脂糖购自上海生物技术工程有限公司；布鲁氏菌液体（Brucella Broth）和布鲁氏菌固体培养基（Brucella Agar）购自美国BD公司；氨苄青霉素和卡那青霉素均购自Sigma公司；其他为国产分析纯化。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

在GeneBank上查找到卡那抗性基因序列和牛种布鲁氏菌标准株2308的VceC基因（BAB1_1058）上下游同源臂基因序列，用Primer 5设计引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物和序列Tab.1 Primers and sequence

1.2.2 VceC基因上下游同源臂和卡那抗性基因的扩增

用牛种布鲁氏菌 2308基因组为模板，以VceC-N-F、VceC-N-R为引物扩增VceC基因上游同源臂；以VceC-C-F、VceC-C-R为引物扩增 VceC 基因下游同源臂。反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性 40 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环；72℃总延伸10 min；最后4℃保存。

以PUC19K质粒为模板，以Kan-F、Kan-R为引物扩增卡那抗性基因，反应条件为：预变性95℃ 5 min；变性 94 ℃ 40 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min 20 s，总延伸 72℃ 10 min，30个循环；最后 4℃ 保存；反应扩增结束后，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。用DNA回收试剂盒说明书回收目的基因。

1.2.3 VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的融合

用VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的胶回收产物按1∶1∶1混合作为模板进行融合扩增，PCR扩增分为2轮。

第一轮PCR反应条件为：预变性 95℃ 5 min；变性 94℃ 30 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，72℃总延伸10 min，10个循环，最后4℃保存。得到缺失突变盒VceC-K。

第二轮反应是以第一轮PCR反应的产物为模板，以VceC-N-F和VceC-C-R为引物进行扩增，反应条件为：预变性 95℃ 5 min；变性 94℃ 40 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 3 min，72℃总延伸10 min，30个循环；最后4℃保存。扩增结束后，PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳。电泳产物根据DNA回收试剂盒说明书进行操作回收。

1.2.4 重组质粒的构建

将回收的缺失突变盒VceC-K与PMD19-T载体相连，连接体系（10 μL），连接产物于16℃水浴锅中过夜连接；将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂平板（卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL），37℃倒置培养过夜。

从过夜培养的平板中挑取单个菌落，接种于800 μL含氨苄和卡那抗性的LB液体培养基中；37℃、120r/min培养 4h后，以 VceC-N-F和VceC-C-R为引物进行菌液PCR鉴定，产物于1%琼脂糖凝胶电泳。将鉴定为阳性的菌液和质粒测序分析。

1.2.5 牛种布鲁氏菌2308-△VceC缺失突变株的构建

将测序正确的重组质粒电转入牛种布鲁氏菌2308感受态中，并且涂平板与含有卡那抗性的布鲁氏菌固体培养基上，37℃培养3-5 d，挑取卡那抗性平板上单克隆菌落接种于含有卡那抗性的布鲁氏菌液体培养基中，37℃摇菌24 h后取100 μL菌液85℃灭活1 h为模板，以VceC-N-F和Kan-R为引物进行PCR扩增鉴定。经过初步筛选的布鲁氏菌突变株经过15次反复传代培养后，分别用外部检测引物和内部检测引物对布鲁氏菌菌进行PCR鉴定和遗传稳定性分析。

1.2.6 牛种布鲁氏菌2308-△VceC缺失突变株生长特性检测

分别挑取2308和2308-△VceC缺失突变株单克隆菌落接种于布鲁氏菌液体培养基中，200 r/min 37℃培养到OD600=0.8时，然后均稀释到OD600=0.1，继续摇床培养，间隔2 h收样测定1次OD600值，直至生长到平台期为止并绘制布鲁氏菌的生长曲线图。

1.2.7 牛种布鲁氏菌2308-△VceC缺失突变株侵染人胚胎滋养层细胞的CFU计数

将长势良好的胚胎滋养层细胞（HPT-8）传到六孔板中，每孔细胞量为106个，加入生长至对数生长期的布鲁氏菌2308和2308-△VceC的菌量为108作用 1 h，然后每孔加入庆大霉素 5 μL（2.5 μL/mL）作用45 min再更换新鲜的细胞培养液，此时开始计时到3、12、24 h时用0.1%曲达通裂解细胞涂布鲁氏菌固体培养基，37℃倒置培养3-5 d，进行CFU计数。

2 结果与分析

2.1 VceC基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因的扩增

以布鲁氏菌2308基因组为模板对VceC基因的上、下游同源臂序列进行PCR扩增，获得大小分别约为517和546 bp的片段，与布鲁氏菌VceC基因上下游同源臂的理论值相符，结果见图1、2。以PUC19K为模板扩增卡那抗性基因，获得的基因片段约为1093 bp，结果见图3。

图1 PCR扩增VceC基因上游同源臂Fig.1 PCR amplification upstream homology arms of VceC gene

图2 PCR扩增VceC基因的下游同源臂Fig.2 PCR amplification downstream homology arms of VceC gene

图3 Kan基因的扩增Fig.3 Amplication Kan gene

2.2 VceC基因上、下游同源臂和卡那基因的融合扩增与载体的构建

PCR技术进行融合扩增，获得大小约2156 bp的基因序列，与VceC上下游同源臂和卡那抗性基因序列叠加的理论值一致，结果见图4。将融合片段与PMD19-T载体连接转化到DH5α，获得的重组载体PMD19-T-ΔVceC-Kan经菌液验证与叠加片段大小相同，结果见图5。

图4 VceC-N-K-C融合PCRFig.4 Fusion PCR of VceC-N-K-C

2.3 布鲁氏菌2308-ΔVceC基因突变株的初步筛选鉴定

将PMD19-T-ΔVceC-Kan质粒电转化到布鲁氏菌2308感受态中，通过VceC基因上下游同源臂基因的互换，卡那抗性基因替换出染色体上的VceC基因，利用卡那抗性来筛选并获得的突变株2308-ΔVceC， 用 VceC-N-F和 Kan-R分 别 对2308-ΔVceC和2308进行扩增鉴定，结果显示，突变株2308-ΔVceC可扩增出大小为1774的特异片段，而亲本株2308未扩增出来（图6），表明抗性基因正确替换了VceC基因。

图6 △VceC缺失株的筛选鉴定Fig.6 Screening and identification of deletion strain△VceC

2.4 布鲁氏菌2308-ΔVceC基因突变株传代

将鉴定正确的突变株2308-ΔVceC传代到第15代，在传代培养过程中与亲本株比较，肉眼未见变化，比如突变株的生长速度，大小形态和菌落颜色等特征。分别用内部检测引物（VceC-F、VceC-R）和外部检测引物（VceC-N-F、Kan-R）对每传一代的菌液进行PCR验证，内部检测引物只有2308株出现特异性条带而外部检测引物只有2308株未出现特异性条带，达到了预想的结果（图7、8），说明成功获得了2308-ΔVceC突变株，并且基因突变株经过15代连续培养后未发生回复突变现象，即2308-ΔVceC可进行稳定遗传。

图5 同源重组载体PMD19-T-ΔVceC-Kan的菌液PCR鉴定Fig.5 Bacteria PCR identification homologous recombination vectors PMD19-T-ΔVceC-Kan

图7 内部引物检测缺失株Fig.7 Internal primer detection deletion strain

图8 外部引物检测缺失株Fig.8 External primers to detect deficient strains

2.5 布鲁氏菌2308-ΔVceC基因突变株生长特性检测

图9 牛种布鲁氏菌2308-ΔVceC缺失突变株与亲本株2308的生长曲线Fig.9 The growth curve ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain

由图9可见，牛种布鲁氏菌2308-ΔVceC和它的亲本株2308生长趋势基本一致，12 h时进入对数生长期，30 h时进入平台期。

2.6 牛布鲁氏菌2308-ΔVceC基因突变株侵染HPT-8细胞

用布鲁氏菌2308-ΔVceC基因突变株和其本株以50∶1的侵染复数侵染HPT-8细胞，在侵染后3、12、24 h时用曲达通裂解细胞收样，并且梯度稀释至102和103，分别涂于布鲁氏菌固体培养基，培养3-5 d数菌落数。计算log值绘制柱状图（图10），侵染12 h后缺失株胞内细菌数量明显下降（P＜0.01）。12 h时亲本株2308和2308-ΔVceC缺失突变株差异显著（P＜0.05）。

图10 牛布鲁氏菌2308-ΔVceC和2308在HPT-8细胞中的存活能力Fig.10 The survival ability ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain in cell HPT-8

3 讨论

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种动物源性人畜共患传染病。该病的典型症状是波浪热，动物发病后最显著症状是引起怀孕母蓄流产和公畜发生睾丸炎、附睾炎或关节炎[4]。人感染布病后，也可导致流产和不育，而且病程长、反复发作、长期不愈，严重危害畜牧业的发展和人类健康。布鲁氏菌T4SS最早在B.suis基因组中发现，位于II号染色体上，是12种蛋白组成的蛋白复合体[5]。Ⅳ型分泌系统主要是通过分泌各种效应分子来逃避宿主细胞的防御机制，对于致病性细菌而言，这些分泌性的蛋白帮助细菌发挥定殖、吸附等作用，还可以调理宿主细胞，逃逸宿主的免疫机制等[6-8]。

VceC和Vce A是第一次被鉴定出的布鲁氏菌T4SS分泌蛋白，其感染布鲁氏菌后，VceC最先进入巨噬细胞[9]。研究人员发现VceC被转运到巨噬细胞中，引起 LDH 释放增加，显示了其细胞毒性，张沾等[10，13]在VceC的研究中也发现其对人的胚胎滋养层细胞具有毒性。研究还证明VceC能够与细胞的Bip蛋白结合，布鲁氏菌利用VceC募集 Bip，从而引起内质网的未折叠反应（UPR），内质网结构被破坏。本研究以牛种布鲁氏菌2308为基础构建分泌蛋白VceC的基因缺失突变株为进一步研究T4SS的分泌蛋白功能提供相关数据。

本研究根据同源重组的原理构建了牛种布鲁氏菌2308-△VceC基因缺失突变株，布鲁氏菌是胞内寄生菌，无质粒，而且大多数外源的质粒不能在其中复制，所以很多质粒均可作为自杀载体来构建布鲁氏菌的基因突变株[12，15-16]，不同于传统的缺失突变株构建载体，本研究中利用T载体来构建牛种布鲁氏菌2308-△VceC基因缺失突变株，抗性基因替换的方法避免了质粒整合带来的问题，此方法较传统构建自杀载体的方法更加简便快速[13-14]，无需酶切连接的过程，简化了突变载体构建的步骤，同时的检出假阳性概率低的优点，可大幅提高研究VceC基因功能的效率，而且此方法具有一个筛选标记，通过筛选可容易得到突变株[13]。

本研究还进一步研究了牛种布鲁氏菌2308-△VceC基因缺失突变株和其亲本株在生长特性上的区别，由图9可见突变株和亲本株在生长趋势上无显著区别，基本趋于一致，所以VceC基因的缺失，不会对牛种布鲁氏菌2308的生长规律或生长状态产生较大影响。其对HPT-8细胞的侵袭力，根据胞内CFU计数结果，12 h时缺失株在胞内的存活率开始下降而其亲本株却开始增殖复制，亲本株2308和2308-ΔVceC缺失突变株在12 h时差异显著。这可能与布鲁氏菌VceC蛋白的功能密切相关。本研究可为布鲁氏菌致病机制的研究奠定一定的基础。

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