LPXTG基序蛋白lmo0160基因缺失对单增李斯特菌生物膜形成的影响

张奇文 ，凌晨 ，马勋 *，薄新文 ，杜冬冬 ，钱凌霄 ，李红欢

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐，830013；3省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院，新疆 石河子 832000）

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种胞内寄生革兰氏阳性短杆菌，可寄生在蜱、蝇、昆虫、鱼及甲壳动物体内，是引起人和动物致病的重要食源性人畜共患病病原菌[1]。该菌具有较强的环境适应性，可在低温、高盐、酸碱等不利的环境条件下生长繁殖，可穿越机体三大屏障，引起菌血症，并引发全身性感染，如败血症、脑膜脑炎、胎膜炎等[2-3]，对新生儿、妊娠母畜和免疫功能不全者等易感动物的发病率和死亡率均较高[4]。该菌被世界卫生组织列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[5]。

生物膜(biofilm，BF)，是指细菌粘附于生物或非生物表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物，是微生物生活时所采取的一种特殊生存状态[6-7]。LM在适宜环境下可形成生物膜，为细菌提供有效庇护所，还能使细菌获得抵抗逃避宿主防御能力和普通抗菌药物。因其抗性强和难清除，从而造成较严重的危害[8]。生物膜多与李氏杆菌病有关，传统的食品加工原辅料富含营养物质，为LM生物膜的形成及生长创造有利条件[9]，LM生物膜使其对消毒剂及光、热、紫外线等的耐受性显著增强，传统的杀菌策略不能有效的处理生物膜，在临床上形成持续感染，对人类公共卫生和畜牧业发展造成严重危害。

LM有一类表面蛋白，其前体蛋白C端含有保守基序LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)，这些蛋白由分选酶(SortaseA，SrtA)通过识别LPXTG保守基序，将蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上，呈现在细胞表面，在感染机体过程中发挥重要毒力作用[10]。LM基因组序列分析预测，有41个LPXTG保守基序蛋白，其中InlF[11]，InlJ[12]，LapB[13]，Lmo1413[14]，actA[15]等部分蛋白的功能已被研究。

本研究通过对LPXTG基序表面蛋白Lmo0160的分子结构特征及结构域的初步分析，可推测Lmo0160的胶原蛋白结合结构域可能在生物膜形成中发挥作用。因此，本研究通过SOE-PCR及同源重组技术构建LM90SB2的Δlmo0160基因缺失株，并分析野生株和lmo0160基因缺失株生物膜形成能力的变化，为进一步了解LM生物膜及其致病性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

LM90SB2分离株是新疆致绵羊脑炎单增李斯特菌分离株，由石河子大学动物科技学院实验室分离、鉴定并保存，血清型为4b型；穿梭质粒pKSV7载体由浙江大学动物科学学院分子微生物与食品安全卫生实验室保存惠赠；pMD19-T(Simple)载体购自大连宝生物 (Takara)公司；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 培养基与试剂

质粒小提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒等购自天根生化科技有限公司(北京)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京诺维森生物科技有限公司；DNA Marker、Pfu DNA 高保真聚合酶、dNTPs等购自北京全式金生物技术有限公司；2×PCR Mix购自上海东盛公司；限制性内切酶 (BamHⅠ和PstⅠ)、T4 DNA连接酶等购自Promega生物技术有限公司 (上海)；氨苄青霉素、氯霉素等购自美国Sigma公司；脑心浸液培养基（brain heart infusion broth，BHI）、胰蛋白胨、酵母浸粉等购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

参照GenBank中参考菌株F2365和EGD-e的序列（ID：AE017262和 AL601824），应用 Primer 5.0软件设计用于扩增lmo0160基因上下游同源臂片段、验证缺失株以及LM的特异性引物，在lmo0160-F1和lmo0160-R2的 5’端分别引入 BamHⅠ和 PstⅠ(斜体下划线部分)和保护性碱基(斜体部分)(表1)，由上海生工有限公司合成。

表1 构建LM90SB2 lmo0160基因缺失株特异性引物Tab.1 Specific primers for construction of lmo0160 gene deletion strain of LM90SB2

1.2.2 lmo0160基因上下游同源臂的扩增

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取LM90SB2的基因组 DNA，用 lmo0160-F1、lmo0160-R1、lmo0160-F2和lmo0160-R2分别扩增上、下游同源臂片段；25 μL 反 应 体 系 ：10×PCR Buffer2.5 μL，PfuDNA 高保真聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR产物经琼脂糖凝胶后，用胶回收试剂盒回收。

1.2.3 lmo0160基因缺失片段的扩增、克隆及测序

以上下游同源臂为模板，采用20 μL反应体系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2.5 μL，上下游同源臂各 3 μL，TapDNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 9 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，12个循环；72 ℃ 10 min。然后加入lmo0160-F1和 lmo0160-R2引物各 0.5 μL扩增 30个循环。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，与pMD19-T(Simple)载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单菌落扩大培养提取质粒，通过 PCR(lmo0160-F1和 lmo0160-R2)和BamHⅠ、PstⅠ双酶切鉴定后筛选出阳性克隆菌，送北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序正确的阳性克隆菌命名为pMD19-T-Δlmo0160。

1.2.4 pKSV7重组穿梭质粒的构建

分别将pMD19-T-Δlmo0160和pKSV7穿梭质粒用BamH Ⅰ和PstⅠ置于37℃水浴中双酶切，酶切3 h后，加入 4 μL 10×Loading buffer终止酶切反应，经凝胶电泳验证正确后切胶回收目的条带，利用T4 DNA连接酶将酶切后的 lmo0160片段连入pKSV7载体；然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌液 PCR(lmo0160-F1和 lmo0160-R2)和双酶切验证成功后，送北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.5 电转后阳性转化子筛选与鉴定

参照文献[16]制备单增李斯特菌LM90SB2感受态细胞。取10 μL pKSV7-Δlmo0160重组穿梭质粒加入100μL LM90SB2感受态细胞中，并将其混匀后加到处理好的电转杯中，冰浴10 min，电转化(2.5 kV，5 ms)后，加入 1 mL BHI(含 0.5 mol/L蔗糖)液体培养基，冰浴30 min后转置30℃恒温培养箱静置3 h，8000 r/min离心5 min，弃上清，剩余菌体涂布于BHI琼脂平板 (含10 μg/mL氯霉素)，30 ℃培养48 h，挑取单菌落置30℃过夜培养，通过菌液PCR(lmo0160-F1和lmo0160-R2)筛选出阳性转化子。

1.2.6 同源重组及lmo0160基因缺失株的鉴定

将上述鉴定的阳性转化子接种于BHI液体培养基，在温度(42℃)和氯霉素抗性(10 μg/mL)的双重压力下进行同源重组。传代培养25代后，挑单菌落，菌液PCR筛选出有氯霉素抗性的单交换重组菌。然后在无氯霉素抗性BHI液体培养基中30℃培养，以丢失抗性质粒。通过影印接种于抗氯霉素和不抗氯霉素BHI板筛选出无抗性的缺失株，再经验证引物和LM特异性引物PCR进一步鉴定。最终得到正确基因缺失株LM90SB2-Δlmo0160。

1.2.7 缺失株生长曲线

挑取LM90SB2、LM90SB2-Δlmo0160单菌落接种于BHI液体培养基中，37℃培养至OD600nm≈0.4，以1∶100的比例分别接种于20 mL BHI液体培养基中，37℃恒温细菌振荡培养箱(180 r/min)培养，每 2 h取 200 μL菌液加入 96孔板中测定 600 nm波长处的光密度值（OD600nm），根据不同时间点的OD600nm值，绘制生长曲线。设置平行组，重复3次。

1.2.8 结晶紫染色法观察生物膜形态

将 LM90SB2、LM90SB2-Δlmo0160 菌液以 1∶100的比例分别接种于新鲜配制BHI液体培养基中，使其 OD600nm≈0.2(约 109CFU/mL)，取 8 mL 菌液分别加入放置有8个无菌盖玻片的90 mm无菌培养皿中，37 ℃培养，分别于 8、12、24和 48 h，无菌取出2个盖玻片于平皿中，加5 mL PBS轻轻晃动，去除悬浮和粘附不牢固的细菌，置55℃干燥箱中干燥30 min，加入1%结晶紫于室温染色30 min，弃结晶紫染液，用PSB洗涤5次，室温下干燥30 min，重复3次。置于显微镜下观察生物被膜的形态，拍照并记录。

1.2.9 结晶紫染色法测定生物膜形成能力

取200 μL OD600nm≈0.2菌液加入到 96孔微孔板中，每个样品分3组，每组设置12个平行重复，并封闭微孔板周围，37℃静置培养，分别于 8、12、24和48 h；弃孔中培养基，加入200 μL PBS洗涤3次，去除浮游菌体，55℃干燥箱中干燥30 min，然后每个孔中分别加入150 μL 1%结晶紫溶液，在室温下染色 30 min，弃染色液，再用 200 μL PBS洗涤5次，55℃干燥箱中干燥30 min；再加入150 μL 95%乙醇脱色30 min，用酶标仪测定其OD570nm值，重复3次。

1.2.10 数据处理

利用Graphpad软件绘制折线图和柱形图，lmo0160基因缺失菌株和野生菌株的生长曲线和生物被膜定量数据分析均采用T检验法进行比较。

2 结果与分析

2.1 lmo0160基因上下游同源臂融合

以 lmo0160-F1 和 lmo0160-R1、lmo0160-F2 和lmo0160-R2为引物分别扩增上、下游同源臂，经凝胶电泳分别得到479 bp单一目的条带(图1)。SOE-PCR融合上、下游同源臂，lmo0160-F1和lmo0160-R2为引物PCR扩增上下游同源臂融合片段，经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为958 bp(图2)。经测序、序列比对分析表明上下游同源臂已成功融合。

图1 lmo0160基因上下游同源臂PCR扩增结果Fig.1 Homologous arms amplified of lmo0160 gene by PCR

图2 lmo0160重叠延伸PCR扩增结果Fig.2 Products amplification of lmo0160 by SOE-PCR

2.2 重组穿梭质粒 pKSV7-Δlmo0160构建及鉴定

Δlmo0160与pMD19-T(Simple)载体连接后，转化至大肠杆菌DH5α中，经PCR鉴定为阳性的菌液，提取质粒经双酶切鉴定得到2692和958 bp 2个条带(图3)，将测序正确重组质粒命名为pMD19-T-Δlmo0160。将同步双酶切胶回收后的Δlmo0160与pKSV7载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，PCR筛选出阳性菌液，提取质粒双酶切鉴定得到6900和958 bp 2个条带(图4)，表明重组穿梭质粒pKSV7-Δlmo0160成功构建。

图3 pMD19-T-Δlmo0160双酶切鉴定Fig.3 Identification of pMD19-T-Δlmo0160 by double enzyme digestion

图4 pKSV7-Δlmo0160双酶切鉴定Fig.4 Identification of pKSV7-Δlmo0160 by double enzyme digestion

2.3 LM90SB2-Δlmo0160缺失株筛选及鉴定

经电转化将pKSV7-Δlmo0160重组载体导入单增李斯特菌感受态细胞内，增菌后，挑取单菌落进行PCR(lmo0160-A和lmo0160-B)鉴定，筛选出的阳性转化子可扩增得到2841和1133 bp目的条带(图5A)；含pKSV7-Δlmo0160质粒的LM90SB2菌株，在温度和氯霉素抗性双重压力下发生同源重组，可获得无氯霉素抗性和不含pKSV7和lmo0160基因的LM90SB2-Δlmo0160菌株，经 PCR扩增得到 1条1133 bp目的条带，表明成功构建了LM90SB2-Δlmo 0160缺失株 (图5B)；37℃无抗性传代培养25代，菌液PCR检测显示：缺失株只能扩增出1133 bp单一条带，野生株只能扩增出2841 bp单一条带，结果表明缺失条带稳定存在，即得到了稳定遗传的lmo0160基因缺失株(图5C)。

图5 LM90SB2-Δlmo0160重组菌PCR检测Fig.5 Identification of recombinant bacteria LM90SB2-Δlmo0160 by PCR

2.4 缺失株生长曲线

将LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160分别置于37℃条件下培养，以测定的OD600nm值为纵坐标，时间为横坐标绘制其生长曲线。

图6 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160的生长曲线Fig.6 Growth curves of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160

由图6可知，培养4 h后，LM90SB2-Δlmo0160生长显著低于LM90SB2，随着时间的推移，OD600nm值差别更加明显(P＜0.01)，说明lmo0160基因很可能是LM正常生长过程中必需的基因，结果显示lmo0160基因的缺失对细菌本身的生长活力造成一定影响。

2.5 lmo0160基因缺失生物膜形态学观察

显微镜下观察细菌生物膜的形态。8和12 h生物膜均为网格结构，但LM90SB2-Δlmo0160菌的聚集程度低于 LM90SB2(图 7A、B、E、F)；24 h 时LM90SB2-Δlmo0160网格结构较LM90SB2松散 (图7C、G)；48 h 时与 LM90SB2-Δlmo0160 相比，LM90SB2形成高度致密的生物膜(图7D、H)。可见lmo0160基因的缺失对LM90SB2形成生物膜的时间和形态有一定程度的影响。

图7 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160形成的生物膜(×400)Fig.7 Formation of biofilm by LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160(×400)

2.6 lmo0160基因缺失生物膜形成能力测定

以测定时间为横坐标，OD570nm值为纵坐标绘制柱状图，8 h和 12 h时，LM90SB2和 LM90SB2-Δlmo0160生物膜生成能力有差异但不显著 (P＞0.05)；24 h时，LM90SB2-Δlmo0160形成生物膜的能力明显低于 LM90SB2，差异显著(P＜0.05)；48 h 时，LM90SB2形成生物膜能力明显高于 LM90SB2-Δlmo0160，差异极显著(P＜0.001)。随着培养时间的延长，lmo0160基因缺失对生物膜形成的影响越明显。

图8 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160的生物膜形成能力Fig.8 The biofilm-forming capability of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160

3 讨论

LM致病过程不仅毒力因子 (如内化素，Act A，李氏杆菌溶血素O，磷酸脂酶C，蛋白Cwh A和金属蛋白酶等)起关键作用[6，9]，生物膜也发挥重要的作用[17]。生物膜是细菌通过分泌胞外基质粘附于生物或非生物表面，并嵌入其所分泌的胞外多聚物中而形成具有一定立体结构的微生物聚集群体[18]。在适宜环境下，LM均可在表面形成生物膜，形成生物膜的菌体在胞外基质的保护下可以增强其耐药性，阻碍临床抗菌药物治疗以及引起宿主免疫反应。

有研究报道[3，10]，SrtA特异识别含有LPXTG保守基序的表面蛋白并将这类蛋白通过蛋白修饰定位到细胞壁上，SrtA基因的缺失导致细菌细胞壁成分的改变，从而对细菌的生长增殖产生一定影响。Lmo0160蛋白属于LPXTG保守基序的表面蛋白，生长曲线测定试验发现lmo0160基因的缺失使得细菌自身的生长繁殖能力显著降低 (P＜0.01)，说明lmo0160基因对细菌自身的生长繁殖能力有一定的调控作用，也提示lmo0160基因可能是细菌生长繁殖中起关键作用的调控因素。

细菌生物膜是机体对抗不利环境的一种自我保护机制，一旦形成后极难去除并增强其耐药性，易造成一些疾病呈现持续性感染并发展为慢性炎症[19]。细菌生物膜形成的动态过程一般为五阶段[20]：浮游细菌可逆性地吸附于生物或非生物表面 (此阶段是抗菌药物发挥药效的最佳时间)；细菌对表面的吸附转变为不可逆的过程，并开始分泌多种表面聚合物(生物膜活性的关键)；早期生物膜结构即微菌落的形成；形成成熟的生物膜 (圆柱形视觉可见的空腔结构)；生物膜中细菌被释放到环境中再次变成浮游菌状态。本试验通过缺失lmo0160基因研究LM90SB2生物膜的生成能力，在显微镜观察发现，基因缺失株形成成熟生物膜的时间比LM90SB2明显延后，且生物膜密度和完整性明显不如LM90SB2。在570 nm波长下测定生物膜生成量，早期阶段8和12 h，有影响但不显著(P＞0.05)；后期24和48 h缺失株生物膜生成能力显著和极显著低于LM90SB2(24 h时，P＜0.05；48 h 时P＜0.001)。这表明 LM90SB2 形成生物膜的能力在一定程度上直接或间接受到lmo0160基因表达的影响。

总之，本试验成功构建了单增李斯特菌lmo0160基因缺失株 LM90SB2-Δlmo0160，并发现 lmo0160基因对LM90SB2生长增殖和生物膜具有一定的调控作用，为进一步阐明LM毒力因子的致病机理奠定了理论基础。

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