响应面法优化浒苔半纤维素的提取条件及其组分分析

吴培凤, 周德庆, 孙 永, 李月欣, 牟伟丽, 刘 楠



响应面法优化浒苔半纤维素的提取条件及其组分分析

吴培凤1, 2, 周德庆1, 孙 永1, 李月欣1, 2, 牟伟丽3, 刘 楠1

(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东青岛266071; 2. 上海海洋大学食品学院, 上海201306; 3. 山东汇洋集团, 山东蓬莱265600)

以浒苔()为原料, 采用响应面法优化碱性过氧化氢提取半纤维素的条件。在单因素实验的基础上, 运用Box-Benhnken中心组合原理, 设计四因素三水平实验, 确定半纤维素最佳提取条件。采用红外光谱(FT-IR)和离子色谱(IC)分析浒苔半纤维素组分。结果表明, 各因素对浒苔半纤维的提取率的影响为: 时间>温度>料液比>氢氧化钠浓度。碱性过氧化氢法提取半纤维素的最佳条件为: 氢氧化钠浓度为4.8 g/L, 提取温度为92℃, 提取时间为5 h, 料液比1︰70, 半纤维素的提取率为56.75%, 与预测值57.30%基本一致。FT-IR结果显示, 浒苔半纤维素红外吸收光谱中含有明显的木糖和阿拉伯糖的特征吸收峰, 为吡喃环结构, 由β-糖苷键连接。离子色谱结果表明, 浒苔半纤维素主要由木糖和阿拉伯糖组成, 含有少量葡萄糖和半乳糖。木糖含量为54.4%, 其次为阿拉伯糖, 含量为15.3%, 葡萄糖和半乳糖含量分别为5.6%和2.7%。

浒苔(); 半纤维素; 分离纯化; 组分分析; 响应面法

浒苔()是一种生长于中潮带滩涂、呈草绿色的世界性温带性大型绿藻[1], 主要生长繁殖期为七八月份, 在我国东南沿海分布广泛[2],近几年青岛海域受到大规模爆发浒苔绿潮的危害[3]。每年打捞的浒苔数以千吨, 但处理浒苔的主要方式为粗加工作为饲料, 造成了较大的浪费[4]。浒苔中含有丰富的半纤维素、纤维素、矿物质、维生素、藻胶等[5-6], 是提取半纤维素的一种优质原料。

半纤维素具有良好的生物活性和化学活性[7], 可作为预防和治疗变性关节疾病的药物[8], 在保健食品、食品包装、医药、造纸等领域有巨大的应用潜力[9]。从植物中获得高纯度半纤维的关键是破坏其与木质素通过酯键形成的大分子网络结构, 以及分解和纤维素通过形成氢键相互作用形成的糖类聚合物[10]。目前, 半纤维素提取的化学方法主要有稀酸水解法、碱提取法和有机溶剂法[11-12]。稀酸水解法需要在较高的温度下进行; 有机溶剂法一般带有毒性与腐蚀性, 不利于保护环境, 处理废液时的成本也较昂贵; 而碱性过氧化氢提取法通过在碱液中断裂纤维素与半纤维素之间的氢键、半纤维素与木质素之间的酯键[13], 降低半纤维素相对分子质量, 使半纤维素溶解在碱液中[14-15], 提高半纤维素提取率。过氧化氢在碱性环境中既有漂白作用与脱木质素作用, 还可以促进半纤维素的溶解[16]。

本研究采用碱性过氧化氢法提取浒苔中半纤维素, 运用响应面法(response surface methodology, RSM)设计实验, 探索浒苔半纤维素的最佳提取条件。红外光谱(FT-IR)和离子色谱(IC)等现代分析检测手段对半纤维素进行组成、性质分析和结构表征, 为浒苔的综合开发利用提供理论基础和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浒苔(2015年夏季采集于青岛附近海域); 阿拉伯糖, 木糖, 葡萄糖, 半乳糖为sigma色谱纯试剂; 过氧化氢(H2O2), 氢氧化钠(NaOH), 95%乙醇等其他本实验所涉及的化学药品均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 半纤维素的提取

采集青岛附近海域浒苔, 将其洗净后45℃烘干[17]。干燥后的样品经粉碎机粉碎后, 过40目筛, 得到浒苔粉末装袋备用。

称取10 g浒苔粉末, 添加含有NaOH和H2O2的水溶液200 mL, 在一定温度下搅拌提取一定时间。将得到的浸提液4000 r/min离心15 min, 得到上清液。用HCl(1 mol/L)调节pH值至7。将浸提液在55℃条件下浓缩至50 mL。采用Sevage法(氯仿和正丁醇比例为5︰1)除去浓缩液中蛋白。将混合物震荡5min后静置萃取, 除去水油层中间的蛋白质层, 反复3次。萃取后加入3倍体积的无水乙醇溶液, 静置过夜析出半纤维素。经4000 r/min离心15 min得到浒苔半纤维素沉淀, 冷冻干燥后研磨, 得到白色粉末状半纤维素。

半纤维素提取率(%)=(1)

式中,1: 半纤维素的质量(g);1: 半纤维素的水分含量(%);2: 浒苔粉的质量(g);2: 浒苔粉的水分含量(%)。

1.3 响应面实验设计

在单因素实验结果的基础上, 应用Design Expert 8.0.5b软件, 按Box-Behnken设计方案, 以半纤维素提取率作为响应函数, 选取适当的因素及水平(见表2), 通过响应面分析得到回归方程, 建立拟合模型, 确定半纤维素提取的最佳条件。

表1 响应面实验设计

1.4 半纤维素组分分析

1.4.1 红外光谱分析

称取1.0 mg半纤维素样品与适量的KBr混合, 研磨均匀[18], 然后放入压片机中制片, 压力大小为20 MPa。将制得的半纤维素薄片, 在4000 cm–1~400 cm–1波数范围内进行红外光谱扫描[19]。通过红外光谱图分析浒苔半纤维素结构与功能基团。

1.4.2 离子色谱分析

1.4.2.1 标准液的配置

分别准确称量阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖标准品0.100 g于100 mL的容量瓶中, 定容、摇匀, 配置0.5、1、2、5 mg/L梯度的标准液。取标准液过0.45 µm滤膜后进样检测。

1.4.2.2 样品预处理

准确称量完全冷冻干燥的浒苔半纤维素粉末样品0.100 g于200 mL烧杯中, 然后向烧杯中移取3 mL 72%(/)的硫酸, 搅拌均匀至样品开始溶解。将烧杯置于30℃水浴锅中水浴1 h, 再加入84 mL去离子水, 用培养皿封住烧杯口径, 小心放入高压灭菌锅内, 121℃下水解1 h。取出后, 冷却至室温, 并用氨水调节水解液pH至中性。将溶液吸入注射器内过0.45 µm的微孔滤膜, 将滤液转移至200 mL容量瓶中定容、摇匀[20]。取1 mL半纤维素水解液, 定容至l00 mL容量瓶中, 摇匀。取适量溶液经0.22 µm的水系微孔滤膜过滤后, 进样检测。

1.4.2.3 色谱条件

柱温: 30℃; 色谱柱: CarboPac PA1(2 mm×250 mm);保护柱: CarboPac PA1(2 mm×50 mm); 检测器: 脉冲安培检测器; 淋洗液: 200 mol/LNaOH。

通过比较标准品和样品的保留时间, 确定样品中的单糖种类, 根据峰面积计算浒苔半纤维素中单糖的百分比。

2 结果分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对浒苔半纤维素提取率的影响

在氢氧化钠浓度5%、过氧化氢浓度1%、料液比1︰80和提取时间4 h的条件下, 考察温度对半纤维素提取率的影响, 结果如图1所示。由图可知, 随着温度升高, 浒苔半纤维素提取率显著增加, 85℃时达到最大。因此选取75、85和95℃作为响应面水平。

2.1.2 提取时间对浒苔半纤维素提取率的影响

在氢氧化钠浓度5%、过氧化氢浓度1%、料液比1︰80和提取温度85℃的条件下, 考察时间对半纤维素提取率的影响, 结果如图2所示。由图可知, 半纤维素提取率随时间的延迟逐渐升高, 在4 h时达到最大。因此选取3, 4和5 h为响应面水平。

2.1.3 料液比对浒苔半纤维素提取率的影响

在氢氧化钠浓度5%、过氧化氢浓度1%、提取温度85℃和提取时间4h的条件下, 考察料液比对半纤维素提取率的影响, 结果如图3所示。由图可知, 当料液比为1︰80时, 半纤维素提取率最大, 当料液比继续增加, 提取率略有下降趋势。适宜的料液比有利于浒苔粉末与碱提液充分接触和有效反应。选取1︰60, 1︰80和1︰100作为响应面水平。

2.1.4 氢氧化钠浓度对浒苔半纤维素提取率的影响

在过氧化氢浓度1%、料液比1︰80、提取温度85℃和提取时间4 h的条件下, 考察氢氧化钠浓度对半纤维素提取率的影响, 结果如图4所示。由图可知, 随着氢氧化钠浓度增加, 半纤维素提取率先升高后降低, 在氢氧化钠浓度为5%时, 半纤维素提取率达到最大。因此, 选择4%、5%和6%作为响应面水平。

2.1.5 过氧化氢浓度对浒苔半纤维素提取率的影响

在氢氧化钠浓度5%、料液比1︰80、提取温度85℃和提取时间4 h的条件下, 考察过氧化氢浓度对半纤维素提取率的影响, 结果如图5所示。从图5可以看出, 当H2O2浓度从0.5% 增加至2.5% 时, 半纤维素得率的变化范围为50.55%~55.39%(经SPSS17.0分析, 在>0.05时, 不存在差异性显著), 可见, 过氧化氢浓度对半纤维素提取率影响较小, 因此, 在响应面设计中, 忽略H2O2浓度的影响, 取其最优值2%。加入过氧化氢后, 提取得到半纤维素为白色粉末见图6, 由于过氧化氢强还原作用, 对半纤维素起到了漂白的作用, 使半纤维素在色泽品质上得到较大的提高。

2.2 响应面实验结果

运用Box-Behnken中心组合原理设计四因素三水平实验, 按照实验条件进行实验, 结果见表2。

表2 响应面设计与实验结果

表3 方差分析

表4 单糖的标准曲线

2.2.1 响应面模型与方差分析

采用响应面法优化浒苔半纤维素提取条件,实验设计及结果见表2。运用Design Expert 8.0.5b数据分析软件对实验数据进行处理,方差分析结果见表3。由表4可知,、、、、2、2、2、2对半纤维素提取率的影响较显著(<0.05)。回归系数2=0.8888, 其校正系数2Adj=0.7775, 表明此模型在实验误差允许范围内, 可有效分析和预测碱性过氧化氢法提取浒苔半纤维素的结果。模型的失拟项=0.6036>0.05不显著, 回归模型预测值与实测值能较好的吻合, 表明模型选择正确。拟合回归方程为:

=+57.01+0.12+0.44+0.30-0.16+0.51-0.87+1.13+1.05+0.12-0.32-1.12-0.612-1.082-0.722

根据表3中值的大小可以判断各因素对半纤维素提取率影响的强弱。各因素对半纤维素提取得率影响程度大小依次为: 提取时间>提取温度>料液比>氢氧化钠浓度。

2.2.2 各因素交互作用

经Design Expert 8.0.5b软件处理得到各因素交互作用的响应面图(见图7)。从图中可以看出各因素交互作用对半纤维素提取率的影响。由图可知, 半纤维素提取率随着因素水平的增大而增大, 当达到某一极值后, 再逐渐减小。由等高线的形状可以看出氢氧化钠浓度和料液比、提取温度和氢氧化钠浓度、提取时间和提取温度对浒苔半纤维素提取率的影响较为显著。

2.2.3 提取条件的优化及验证

响应面实验结果表明, 碱性过氧化氢法提取浒苔中半纤维素的最佳条件是氢氧化钠浓度4.80 g/L, 提取温度为91.67℃, 提取4.82 h, 料液比1︰73.08, 半纤维素提取率最大理论值为57.30%。为验证响应面优化结果的可靠性, 采用最优提取条件重复试验3次(为实际操作方便, 确定氢氧化钠浓度4.8 g/L, 提取温度为92℃, 提取时间为5 h, 料液比1︰70), 实际半纤维素平均提取率为56.75%, 与理论误差为0.96%, 与最大理论值拟合良好。因此建立的模型能够可靠地预测碱性过氧化氢法提取浒苔中半纤维素的提取率。

2.3 浒苔半纤维素组分分析

2.3.1 红外光谱分析结果

在4000 cm–1~400 cm–1范围内, 对半纤维素样品进行了红外光谱扫描, 得到半纤维素的FT-IR谱图如图8所示。从图谱可知, 3423.01 cm–1处为—OH的伸缩振动的吸收峰, 表明碱性过氧化氢法提取得到的半纤维素含有羟基结构[21]; 1043.81 cm–1处为木糖C—O—C吡喃环伸缩振动引起的[22]; 1120.13 cm–1~ 920.34 cm–1之间的吸收峰表明半纤维素中阿拉伯糖基木聚糖的存在[23]; 2931.04 cm–1为甲基和亚甲基的C—H伸缩振动吸收峰[24]; 881.25 cm–1处较大吸收峰表明半纤维素中糖单元间由β-糖苷键连接[25]; 1616.87 cm–1处是C=O伸缩振动吸收峰[26], 表明半纤维素样品中糖醛酸的存在。

2.3.2 离子色谱分析结果

2.3.2.1 标准品曲线的绘制

如图9所示, 4种单糖在15 min之内即完全出峰。以质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 制作标准曲线, 其回归方程和相关系数列入表5。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及木糖在此测定条件下呈现良好的线性关系。

1-阿拉伯糖; 2-半乳糖; 3-葡萄糖; 4-木糖

2.3.2.2 半纤维素离子色谱分析结果

根据标准曲线, 计算出浒苔半纤维素中各种单糖的含量(%)。浒苔半纤维素各单糖含量结果见图10。浒苔半纤维素主要包括木糖和阿拉伯糖, 含有少量葡萄糖和半乳糖, 其中, 木糖含量高达54.4%, 阿拉伯糖含量为15.3%, 葡萄糖为5.6%、半乳糖2.7%。

3 结论

采用碱性过氧化氢法提取浒苔半纤维素, 以半纤维素提取率为指标, 运用响应面法设计四因素三水平实验。结果表明提取浒苔半纤维素的最佳条件是: 氢氧化钠浓度4.8g/L, 提取温度为92℃, 提取时间为5 h, 料液比1︰70, 半纤维素提取率为56.75%。红外光谱(FT-IR)对半纤维结构表征的结果表明, 浒苔半纤维素由β-糖苷键连接, 其中的木糖和阿拉伯糖残基为吡喃环结构。离子色谱法分析其组分含量结果表明, 浒苔半纤维素主要由木糖和阿拉伯糖组成, 含有少量葡萄糖和半乳糖。其中木糖含量高达54.4%, 其次为阿拉伯糖, 含量为15.3%, 葡萄糖和半乳糖含量分别为5.6%和2.7%。

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Optimization of hemicellulose extractionfromusing response surface method and component analysis

WU Pei-feng1, 2, ZHOU De-qing1, SUN Yong1, LI Yue-xin1, 2, MU Wei-li3, LIU Nan1

(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China;2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Shandong Huiyang Group, Penglai 265600, China)

We optimizedalkaline hydrogen peroxide extraction conditions of HC inby RSM usingBox–Behnken central composite principle to design experimentswith fourfactorsand threelevels. HC components wereanalyzed usingFT-IR and IC. The results showed that the followingfactors influencethe extraction amount of HC in that order: time> temperature > ratio ofto solvent > concentration of sodium hydroxide. The optimal extraction conditions included a solid to liquid ratio of 1︰70, sodium hydroxide concentration of 4.8g/L, temperature of 92℃), and extraction time of 5h. The extraction rate wasobserved to be 56.75%, consistentwith the predicated value of 57.30%. FT-IR results showed that HC contains xylose and arabinose absorption peaks and pyran ring structure connectedby beta-glycosidic bond. IC results showed that HC was mainly comprisedxylose (54.4%), arabinose (15.3%), glucose (5.6%), and galactose (2.7%).

; Hemicellulose; Separation and purification; Component analysis; Response surface methodology

TS254.8

A

1000-3096(2017)01-0048-09

10.11759/hykx20160130001

2016-01-30;

2016-05-25

中央级公益性科研院所基本科研业务费(20603022015001); 烟台市高端人才引进‘双百计划’(XY-04-18-01)青岛市市南区科技发展资金项目(2014-14-008-SW)

吴培凤(1987-), 女, 山东临沂人, 硕士研究生, 主要从事海洋活性物质研究, 电话: 0532-85802889, E-mail: sunnyday2013@126.com; 刘楠, 通信作者, 助理研究员, E-mail: liunan@ysfri.ac.cn

Jan. 30, 2016

[Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institutes (20603022015001); ‘Yantai Double Hundred Talent Plan’(XY-04-18-01); Fund of Science and technology development of Shinan District, Qingdao (2014-14-008-SW)]

(本文编辑: 康亦兼)