凡纳滨对虾碱性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表达及盐度应答效应

张明明, 王 雷, 王宝杰, 刘 梅, 战文斌, 蒋克勇



凡纳滨对虾碱性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表达及盐度应答效应

张明明1, 3, 王 雷2, 3, 王宝杰2, 3, 刘 梅2, 3, 战文斌1, 蒋克勇2, 3

(1. 中国海洋大学水产学院, 山东青岛 266003; 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东青岛 266071; 3. 中国科学院实验海洋生物学重点实验室, 山东青岛 266071)

本研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)首次克隆得到凡纳滨对虾()碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)基因的cDNA全长序列, 其中ALP基因全长序列1 910 bp, 编码536个氨基酸; ACP基因全长序列1 544 bp, 编码439个氨基酸。盐度调控设3个盐度组: 31(对照)、16和3。养殖45 d后, 荧光定量PCR测定对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠和鳃5个组织中的ALP和ACP 基因mRNA的表达情况。RT-PCR显示, ALP基因在5个组织中普遍表达, 在肝胰腺中表达量最高(<0.05), 肠道中的表达量最低(<0.05); ACP基因在5个组织中也均表达, 在肝胰腺和鳃中表达量明显高于其他3个组织(<0.05)。盐度应答实验表明, 不同盐度条件下, 不同组织中, ALP和ACP基因存在不同的表达模式。在胃和鳃组织中, ALP基因在31盐度组的表达量显著高于其他两组(<0.05); 在肝胰腺和肠道中, ALP基因在16盐度下的表达量明显低于其他两组(<0.05); 在肌肉中, ALP基因的表达与其他组织均不同, 31盐度组表达量最高, 而16盐度组最低(<0.05); 在肝胰腺中, ACP基因在31盐度组的表达量明显低于其他盐度组(<0.05); 在肌肉和鳃两个组织中, ACP基因在31盐度下的表达量明显高于其余两个盐度组(<0.05); 在肠道中, ACP基因的表达量在3盐度组明显高于其他两组(<0.05); 而在胃中, ACP基因在3个盐度下的表达量没有显著性差异。上述结果为研究低盐条件下凡纳滨对虾的磷酸酶基因的变化机制提供了参考。

凡纳滨对虾(); ALP基因; ACP基因; 克隆表达; 盐度

凡纳滨对虾()俗称南美白对虾, 原产地为太平洋沿岸水域[1], 是广盐性的优良虾种。凡纳滨对虾具有生长迅速、出肉率高、抗病能力强、适于高密度养殖及对盐度的适应能力强等特点, 另外根据联合国粮农组织(FAO)数据统计结果显示, 自20世纪80年代初以来全球对虾养殖产量不断增加, 越来越多的消费者把虾作为重要的蛋白质来源[2], 对虾在淡水、半咸水和海水中有着大规模的养殖[3], 其养殖区域也由沿海进一步向着内陆延伸[4]。

盐度是对虾养殖过程中重要的环境因子[5], 影响对虾的渗透压调节和能量收支等方面。有研究认为凡纳滨对虾的等渗点在25附近[6]。目前的文献研究得到的最适生长盐度并不一致, Samocha[7]等研究认为凡纳滨对虾生长的最适盐度在2~8, Bray[8]等研究认为最适生长盐度在5~15; Ponce-Palafox[9]等研究认为最适生长盐度在33~40。朱春华[10]研究认为盐度14~22是凡纳滨对虾的最适生长盐度, 环境盐度为18时生长速度最快, 也有研究认为15~25是凡纳滨对虾生长的理想盐度范围[4]。

磷酸酶(phosphatase)是一种正磷酸单酯酶, 能够催化各种含磷化合物的水解反应, 根据他们起催化作用的最适pH不同, 可分为碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP), 它们是动物体内解毒体系的重要组成, 并且在动物机体的骨化过程以及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中都起着重要作用[11]。ALP广泛存在于人体动物、植物和微生物中, 是生物代谢的重要酶类, 在碱性条件下的水解反应外, 还可以参与磷酸基团的转移反应, 参与对虾体内能量的收支平衡。ACP来自于颗粒细胞的颗粒体, 是巨噬细胞内溶酶体的标志酶, 是溶酶体的重要组成部分[12], 作为生物体内重要的代谢酶和免疫酶, 主要参与磷酸酯的代谢, 与细胞的消化代谢[13]、自溶过程和免疫调节[14]有关。

目前, 对盐度影响凡纳滨对虾ALP和ACP的研究多集中在盐度突变和盐度的长期效应对ALP和ACP酶活力的影响, 而盐度的长期效应对于ALP基因和ACP基因表达的影响研究相对较少。本实验通过研究盐度的长期效应对不同组织中ALP基因和ACP基因表达的影响, 旨在为凡纳滨对虾适应低盐度养殖的磷酸酶类分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

凡纳滨对虾取自胶南养殖场, 原养殖环境盐度为31, 无外伤, 体色正常, 规格一致, 体长平均在8 cm左右。

1.2 实验设计

实验设置3个盐度梯度, 分别是3、16和31, 以正常海水31作为对照组, 在1.5 m³养殖循环水箱中进行。每缸放养90尾对虾, 每个梯度设3个平行组。低盐度组用正常海水和淡水进行调节, 以每天3的速率降低至16和3盐度后正式开始实验, 养殖周期45 d, 试验期间水温范围为22~28℃, 每天换水1次, 换水量1/3, 吸污1次, 投饵2次。

1.3 样品采集

各组在设定的盐度中养殖45 d后取样, 每组取对虾3尾。分别取对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠、鳃5个组织, 放于1 mL RNAguard中, 上述样品放于–80℃低温保存备用。

1.4 RNA提取和cDNA克隆

1.4.1 RNA的提取

取对照组31盐度组的凡纳滨对虾肝胰腺, 利用上海飞捷生物技术有限公司总RNA极速抽提试剂盒提取总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.4.2 目的片段的克隆

用TransScript ® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转成cDNA后–20℃冰箱保存。参照近缘虾类ALP和ACP核苷酸序列, 用Primer Premier5设计性引物(表1)。片段克隆PCR反应: 94 ℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 退火温度30 s, 72℃ 60 s, 35个循环; 72℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物; Bio-Rad凝胶成像系统分析获得目的条带, 目的片段产物利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0进行凝胶回收; 连接pEASY-T1载体; 转化到Trans-T1感受态细胞; 氨苄抗性固体培养基37℃过夜培养; 挑菌, 以氨苄抗性液体培养基培养; 菌体PCR检测; 阳性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.4.3 基因全长的克隆

3′RACE: 以3′CDS为引物反转录合成cDNA为模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5软件设计特异性引物(表1), 利用特异性引物和UPM、NUP进行巢式PCR(Nested-PCR)。电泳, DNA片段回收, 连接, 转化, 测序方法同前。5′RACE: 5′RACE实验参考孙姝娟等[15]的方法, 并对部分细节进行了改动。以oligo(dT)为引物反转录合成cDNA为模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5软件设计特异性引物(表1)。在合成的cDNA末端加上polyC尾, 用接头引物oligo(dG)-adaptor分别和基因特异性引物进行Nested-PCR。电泳, DNA片段回收, 连接, 转化, 测序方法同前。

1.5 基因序列分析

用ORF Finder (Open Reading Frame Finder)(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)预测ORF和翻译的蛋白序列。Prot-param (http: //web.expasy.org/protparam/)用于预测翻译蛋白的理化特征分析。SingalP3.0Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/SingalP)寻找基因可能存在的信号肽序列, 使用NetPhos2.0 Server (http: // www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点, 使用NetNGlyc1.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)预测糖基化位点, Prosite(http: //prosite. expasy.org/)和采用SMART (http: //smart.embl-heidelberg. de/)用于预测蛋白功能结构域。Swiss-model模型用于预测蛋白的高级空间结构(http: //swissmodel.expasy. org)。BioEdit(http: //www.mbio.Ncsu.edu/BioEdit)软件用于氨基酸的多序列比对。分子进化树构建用MEGA4.0软件。

表1 ALP和ACP基因克隆和荧光定量引物

1.6 荧光定量PCR

根据ALP和ACP的cDNA序列设计荧光定量引物(表1)。以β-actin为内参基因, 检测凡纳滨对虾在不同盐度不同组织中ALP和ACP的表达水平。用TaKaRa SYBR Green Premix Ex TaqTM||试剂盒。在罗氏荧光定量PCR仪上进行反应, 实验设3个重复。荧光定量采用两步法, PCR程序: 94℃30s; 94℃5s, 退火30s, 40个循环; 溶解。用2–ΔΔCt法处理各基因荧光定量所得数据, 并分析扩增效率。

1.7 数据处理

实验数据用平均值±标准差表示, SPSS17.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 进行Duncan’s多重比较, 当<0.05时, 表示差异显著。

2 结果

2.1 基因克隆及序列分析

2.1.1 凡纳滨对虾ALP基因全长克隆及序列分析

克隆得到凡纳滨对虾ALP cDNA全长序列1 910 bp(GenBank登录号: R534873.1), 包括156 bp的非编码区(Untranslated Region, URT), 143 bp的3’URT和1611的ORF。该基因编码536个氨基酸, 预测蛋白质分子量为58.67 kDa, 等电点为5.02, 含有12个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点以及12个酪氨酸磷酸化位点和3个糖基化位点。SMART预测凡纳滨对虾ALP的结构域, 结果显示, 第88~526位置的氨基酸为ALP的核心结构域alkPPc(Alkaline phosphatase homologues), alkPPc是ALP蛋白家族所共有的结构域(图1A)。

2.1.2 凡纳滨对虾ACP基因全长克隆及序列分析

克隆得到凡纳滨对虾ACP cDNA全长序列1 544 bp (GenBank登录号: KR676 449.1), 包括63 bp的非编码区(Untranslated Region, URT), 161 bp的3′URT和1427的ORF。该基因编码439个氨基酸, 预测蛋白质分子量为50.73 kDa, 等电点为5.15, 含有7个丝氨酸磷酸化位点、5个苏氨酸磷酸化位点以及8个酪氨酸磷酸化位点和5个糖基化位点。SMART和NCBI预测凡纳滨对虾ACP的结构域, 结果显示, 第230~429位置的氨基酸为ACP的结构域MPP_PAPs (purple acid phosphatases of the metallophosphatase superfamily)(图1B)。

2.2 空间结构模拟

采用SWISS-MODEL软件的同源建模方法, 分别将ALP蛋白序列和ACP蛋白序列与软件搜索得到的模(PDB code: 1shq.1和PDB code: 2qfr.1), 人工进行联配, 以ALP和ACP推导的氨基酸构建其三维结构(图2), ALP有42个α-螺旋, 58个β-折叠和111个β-转角, ACP有8个α-螺旋, 30个β-折叠和50个β-转角。

上面大写字母为核苷酸序列, 下面字母为对应的编码的氨基酸序列; 起始密码子(ATG)、终止密码子(TAG)用加粗标示; 丝氨酸、酪氨酸以及苏氨酸磷酸化位点分别用“□, =, _”标示; alkPPc(ALP的结构域)以及MPP_PAPS(ACP的结构域)用灰色底纹标示

Capital letters separated by spacesrepresent the coding sequence, with the nucleotide sequence above. The initiation codon(ATG) and the stop codon(TGA) arecharacterized in bold. Potential phosphorylation sitesof the Ser, Tyr and Thr are indicated by “□, =, _” respectively.The alkPPc domain and MPP_PAPS are shaded

2.3 多重比对及系统发育树的构建

使用BioEdit软件将已推导的ALP和ACP氨基酸序列和其他物种的ALP和ACP进行多序列比对。经过比对可知: 凡纳滨对虾ALP与湿木白蚁()、北方长额对虾()的ALP氨基酸序列的一致性相对较高,可达到44%、46%, 与斑马鱼()、小鼠()、人()的一致性相对较低分别为37%、36%、36%(图3); 凡纳滨对虾ACP氨基酸序列与致倦库蚊()的ACP氨基酸序列的一致性较高可达到54%, 与果蝇()、小鼠、人的氨基酸序列一致性较低分别为12%、9%、8%(图4)。

根据NCBI上已有的ALP和ACP氨基酸序列, 利用MEGA4.0软件, 以邻位相连法构建系统进化树。结果表明, 在无脊椎动物里, 凡纳滨对虾ALP与北方长额对虾ALP遗传距离较近聚成一支, 并且它们与湿木白蚁聚成了节肢动物独立的一支, 其他物种和凡纳滨对虾ALP距离较远(图5)。凡纳滨对虾ACP与罗氏沼虾()ACP遗传距离较近聚成了一支, 并且它们与致倦库蚊聚成了一支, 其他物种和凡纳滨对虾ACP距离较远(图6)。

左侧物种名称及相应的登录号分别为: 凡纳滨对虾(ALC78852.1); 北方长额对虾(CAC35697.1); 斑马鱼(AFU97155); 小鼠(CAA31775); 人(AAH09647); 湿木白蚁(KDR12134.1)。ALP核心结构用方框标示, 酶活性中心区域用“▲”标示, 保守的Cys用黑体加阴影标示, N糖基化位点下划线标示。可能的Mg结合位点用“■”表示, Ca结合位点用“□”标示, Zn1+结合位点用“●”标示。Bioedit比对后相同氨基酸残基用“*”标示, 相似的氨基酸残基分别用“:”或“.”标示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78852.1);(CAC35697.1);(AFU97155);(CAA31775);(AAH09647); and(KDR12134.1). Boxed aminoacids correspond to the ALP domain. Cysteins are shaded in black. The active site is marked with “▲”. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to magnesium “■”, to calcium “□” and to Zn1+“●” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

左侧物种名称及相应的登录号分别为: 凡纳滨对虾(ALC78849.1); 人(NP_149059.1); 果蝇(BAF47908.1); 小鼠(NP_001181963.1); 致倦库蚊(XP_001851362.1); 凡纳滨对虾ACP的核心结构域用方框标示, 保守的Cys用黑体加阴影标示, N糖基化位点下划线标示。金属离子结合位点用“■”标示。Bioedit比对后相同氨基酸残基用“*”标示, 相似的氨基酸残基分别用“:”或“.”标示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78849.1),(NP_149059.1),(BAF47908.1),(NP_001181963.1), and(XP_001851362.1).Boxed aminoacids correspond to the ACP domain. Cysteins are shaded in black. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to metal ions “■” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

2.4 ALP基因以及ACP基因mRNA组织表达模式

凡纳滨对虾ALP和ACP在各组织中的表达结果分别如图7A和图7B所示。在5个组织中均检测到ALP基因mRNA且组织分布存在差异, ALP在肝胰腺中表达量最高, 且明显高于其他组织(<0.05), 在肠中表达量最低, 且明显低于其他组织(<0.05), 在肌肉、鳃和胃组织中未产生明显差异。同样, 在5个组织中也均检测到了ACP 基因mRNA表达, ACP基因在肝胰腺和鳃中表达量较高, 且明显高于其他组织(<0.05), 在肌肉、胃和肠中表达量较低, 并且未产生显著性差异。

2.5 盐度调控ALP和ACP表达规律

由图8A可知, 在不同盐度下, ALP基因在不同组织中的表达规律不同。在胃和鳃中, 31盐度组ALP基因的表达量均显著高于16和3盐度组(<0.05), 16盐度组和3盐度组之间差异不明显; 在肝胰腺和肠道中, 16盐度组ALP基因的表达量均明显低于31和3盐度组<0.05), 而31和3盐度组之间未产生明显差异。在肌肉中的表达规律与其他组织均不同, 31盐度组表达量最高, 其次是3盐度组, 而16盐度组表达量最低, 且3组之间存在显著性差异(<0.05)。

由图8B可知, 在不同盐度下, ACP基因在不同组织中的表达规律也不相同。在肝胰腺中, 31盐度组ACP基因的表达量明显低于16和3盐度组(<0.05), 而16和3盐度组之间没有明显差异; 在肌肉和鳃中, 31盐度组ACP基因的表达量最高, 明显高于16和3盐度组(<0.05), 16和3两组之间差异不明显; 在肠道中, 3组盐度组ACP基因的表达量明显高于其余两个盐度组(<0.05), 其余两个盐度组之间没有显著性差异; 而在胃中, 3个盐度组之间ACP基因的表达量没有显著性差异。

. 凡纳滨对虾;. 斑马鱼;. 人;. 大黄鱼;. 小鼠;. 大西洋鲑;. 湿木白蚁;. 牛;. 猕猴;. 北方长额对虾;. 合浦珠母贝;. 非洲爪蟾

. 凡纳滨对虾;. 人;. 密西西比鳄;. 致倦库蚊;. 家鼠;. 家牛;. 罗氏沼虾;. 马氏珠母贝;. 非洲爪蟾

不同字母表示结果之间存在显著性差异(<0.05)

Different letters indicate a significant difference(<0.05)

同一组织之间不相同字母表示存在显著性差异(<0.05)

Different letters from the same group indicate a significant difference(<0.05)

3 讨论

3.1 凡纳滨对虾ALP和ACP结构及组织分布

磷酸酶作为生物体内广泛存在的单酯水解酶, 在人、鼠、牛等方面的研究较为广泛。磷酸酶基因的研究在人和鼠中的报道较为丰富, 但是在水生动物中的研究较多集中于组织学、酶的生化性质等方面, 关于基因的表达和调控的报道还不多[16]。本实验采用RACE的方法[17]克隆出凡纳滨对虾ALP和ACP基因的全长cDNA序列。ALP基因(GenBank登录号: R534873.1)共编码536个氨基酸, 其编码的氨基酸序列和湿木白蚁、北方长额对虾等ALP氨基酸有一定的相似性(45%~47%), 多重比对结果表明, 不同物种的ALP具有较高的相似性, 具有多个与Mg离子和Zn离子的结合位点, 并且具有ALP家族共有的alkPPC结构域和ALP家族的保守序列[18]。系统发育树表明, 凡纳滨对虾ALP和罗氏沼虾ALP聚为一支, 比和湿木白蚁这类节肢动物的亲缘关系更进一步。另外本实验克隆得到的ACP基因(GenBank登录号: KR676449.1)共编码439个氨基酸, 二级结构预测结果显示其结构以β-折叠为主, 仅含有少量的α-螺旋。从NCBI查找其他物种的ACP氨基酸序列, 多重比对结果显示, 其编码的氨基酸序列和致倦库蚊、罗氏沼虾等有较高的相似性(54%~57%), 具有ACP基因家族的核心结构域MPP_PAPs, 含有可能与金属离子结合的多个位点。系统进化树表明, 凡纳滨对虾ACP与罗氏沼虾ACP聚为一支, 并且这两个物种与致倦库蚊构成了节肢动物分支, 符合生物进化理论。

目前, ALP基因在动物中进行了广泛的研究, ALP基因是在脊椎动物发育中的表达水平在时间和组织特异性方面有所不同[19]。有研究报道, 人和鼠的基因已经被克隆[20], 并且在人和鼠中存在多种ALP, 在人和鼠中分别具有3种和2种组织特异性ALP[21], 分别是人的肠ALP、胎盘ALP和生殖细胞ALP; 小鼠的肠ALP和胚胎ALP[22]。在人和鼠中还具有一种组织非特异性的ALP(tissue-non-specific alkaline posphatase), 在肝、早期胚胎、肾以及骨骼等多种组织中表达。同时有研究报道, 文昌鱼早期发育过程中存在肠特异性ALP和非组织特异性2种ALP[21]。施志仪[16]等实验结果表明, 牙鲆ALP是组织非特异性的碱性磷酸酶类。本实验中, RT-PCR结果显示, ALP基因在凡纳滨对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠和鳃5个组织中均有表达, 从其mRNA的表达特点可知, ALP在凡纳滨对虾体内的分布是组织非特异性的ALP, 但是肝胰腺和鳃中表达量较高, 在肌肉、胃和肠中的表达量较低, 说明ALP基因的表达水平在不同组织中存在差异性[23], 张辉[24]在对日本沼虾的研究同样表明了ALP基因在不同组织中的表达水平具有差异性。ALP是有一个多基因家族编码, 在动物的早期发育时期存在多种类型, 对于ALP在凡纳滨对虾发育时期是否存在其他种类, 有待进一步研究。ACP同样是生物体内分布很广的磷酸酶类, 从低等生物大肠杆菌、酵母到高等动植物体液、组织到人类肝脏、前列腺等都广泛存在[25]。但是目前的研究也多集中在ALP方面, 对于水生动物的ACP表达分布研究较为匮乏, 本研究表明, 与ALP一样, ACP在对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠道和鳃中都普遍存在, 是组织非特异性的磷酸酶, 但是在不同组织中ACP的表达水平是不同的并且存在差异性, 至于在发育时期是否和ALP一样存在多种类型, 需要进一步的实验。

3.2 盐度调控对ALP基因和ACP基因的影响

ALP和ACP是生物代谢的重要酶类, 参与磷酸基团的转移反应以及对虾体内能量的收支平衡, 当机体处于耗能状态时, ALP和ACP参与机体内的能量代谢并且释放能量, 来满足机体生命活动的需要。

当机体处于高盐环境时, 凡纳滨对虾需将体内多余的盐分排出体外, 在较低的盐度条件下又需要补入盐分, 这个过程中, 凡纳滨对虾要消耗体内储存的能量进行渗透调节, 来维持机体内正常的水分[26]。有研究认为凡纳滨对虾的最适生长盐度在14~22[10], 当机体处于这一盐度下, 维持渗透压所需要消耗的能量较少, 盐度低于10和高于26时, 因为自身存在较大的渗透压差, 虾体为维持自身的渗透压平衡, 消耗更多的能量, 并且有研究认为肌肉、胃、肠和鳃作为机体的排盐器官[27], 在机体机体调节渗透压的过程中起着十分重要的作用。本次试验过程中, ALP基因在肌肉、胃、鳃和肠4个组织中在16的盐度中表达量最低, ACP基因在以上4个组织中也具有相同的表达规律, 可能是因为当对虾处于16的环境时, 更接近它的等渗点(25)和最适生长盐度(14~22), 用于维持渗透压所需要的的能量较少, 从而使ALP和ACP在排盐器官中的表达量相对于原环境31的表达量有所减少, 当机体处于3时, 推测在耗能的过程可能刺激了ALP和ACP在排盐器官中的表达, 参与能量的代谢过程, 释放出能量, 以维持机体对能量的需求。

在甲壳动物所有组织中, ACP作为一种参与机体代谢和免疫的酶类, 广泛分布于动物组织中, 在人体主要存在于肝脏、脾脏、红细胞和骨髓等部位[28]。ACP不仅参与磷酸酯代谢, 在酸性条下催化磷酸单酯水解, 在代谢调节、能量转化及信号传导上起着重要作用。同时, 作为溶酶体标志酶, 参与消化生物大分子以维持细胞的正常代谢活动, 参与清除衰老或死亡的细胞和细胞器。参与识别、吞噬和降解入侵的病原体, 在免疫防护方面起重要作用[19], 同时肝胰腺是对虾重要的器官之一, 是众多生命大分子的主要合成场所, 在合成和分解代谢等方面具有重要功能[29], 组织细胞中的离子水平稳定性对其完成正常生理功能非常重要[30]。不同盐度养殖后, 肝胰腺中ACP基因在3和16两组盐度中表达量相对较高, 与其他组织的表达规律不同, 可能与凡纳滨对虾的机体的免疫状态和机体器官有关系, 有关低盐养殖中ACP在不同组织中的表达机理有待进一步研究。

目前有关盐度对于ALP和ACP影响的研究多集中在酶活方面, 通过盐度胁迫来观察酶活力的变化情况。有研究表明在对虾的组织中, 盐度为16组的ALP和ACP的活力明显高于32和4组[31], 在对虾肝胰腺中30组的ALP和ACP活力高于1.5[27]。李华[31]的研究中, 设置3个盐度组(4、18、32)养殖30 d, 在0~15d内对虾必须进行不断的渗透调节而达到新的渗透平衡状态, 进而导致对虾体内(血淋巴组织)免疫生理指标发生了变化, 15~30d时, 各盐度组对虾体内的免疫生理指标(碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶)均趋于稳定, 30 d的测定结果与15 d时相比差异很小, 盐度32组在整个实验过程中, 未经历盐度驯化过程, 各指标表现基本稳定。结果表明, 当凡纳滨对虾适应了新的养殖环境后, 各项免疫生理指标均在盐度18时最高, 盐度4时次之, 盐度32时最低, 盐度过高和过低都会对其产生不利的影响。梁萌青[28]研究发现, 水体盐度为30的凡纳滨对虾肝胰脏碱性磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性明显高于1.5组的养殖对虾。在本次试验中凡纳滨对虾经过45 d的盐度胁迫后, ALP和ACP基因的相对表达量在不同组织中的表达规律与现阶段报道的酶活力的规律有所不同, 有研究认为盐度调控后, ALP和ACP基因在表达ALP和ACP的过程中的这些不同, 可能与蛋白质合成的活性的迅速变化有关[32]。同时推测这些变化可能与组织的内部结构以及组织特性有关, 在这个过程中发生的具体变化有待进一步的研究。

综上, 本实验从凡纳滨对虾中成功克隆到ALP和ACP基因的cDNA全长, 利用RT-PCR研究了不同盐度下ALP和ACP基因在不同组织中表达情况, 这些数据可以为研究低盐养殖环境下凡纳滨对虾的磷酸酶类分子机制提供参考。

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cDNA cloning and gene expressionin response to salinity of alkaline phosphatase and acid phosphatase from

ZHANG Ming-ming1, 3, WANG Lei2, 3, WANG Bao-jie2, 3, LIU Mei2, 3, ZHAN Wen-bin1, JIANG Ke-yong2, 3

(1. Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

In this study, alkaline phosphatase (ALP) and acid phosphatase (ACP) genes were cloned fromby the rapid amplification of cDNA endsmethod.The full-length cDNA sequence of ALP was 1 910 bp, encoding 536 amino acids, whereas the full-length cDNA sequence of ACP was 1 544 bp, encoding 439 amino acids.A salinity regulation experiment was performed with three treatments: 31‰ (control), 16‰, and 3‰ salt water.ALP and ACP gene expression was determined in tissues of the hepatopancreas, muscle, stomach, intestine and gills with real-time PCR after 45 days in saline. RT-PCR reveals that the ALP gene was detected in five tissues with the highest expression in the hepatopancreas(<0.05) and the lowestin theintestine (<0.05). The ACP gene was also detected in five tissues, and the gene expression in the hepatopancreas and gills was higher than that in the other tissues (<0.05). After the salinity regulation experiment, the ALP and ACP genes presented different expression patterns among the various tissues. In the stomach and gill tissues, the higher expression level of the ALP gene occurred in the 31‰ saline group compared with the other two salinity groups (<0.05); in the hepatopancreas and intestinal tissues, the expression level of the ALP gene in the 16‰ saline group was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle tissue, the expression level of the ALP gene was the highest in the 31‰ saline group (<0.05) and the lowest in the 16‰ salinegroup (<0.05). Whereas in the hepatopancreas, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle and gill tissues, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly higher than that in the other two salinity groups (<0.05); in the intestines, the expression of the ACP gene was the highest in the 3‰ salinegroupand was significantly higher than that in the other two groups (<0.05); in the stomach, the expression level of the ACP gene was not significantly different among the three groups. These results provide useful data for the molecular mechanism ofphosphatase metabolism under conditions of low salinity.

; alkaline phosphatase; acid phosphatase; cloning and expression; salinity

S968.22

A

1000-3096(2017)01-0083-13

10.11759//hykx20160112002

2016-01-12;

2016-05-04

国家自然科学基金项目(41271547, 41401644); 中国科学院战略性先导科技专项(XDA05010400)

张明明(1989-), 女, 山东菏泽人, 硕士研究生, 主要从事水产养殖工作, 电话: 13075370324, E-mail: zmm15092858971@163.com;蒋克勇, 通信作者, E-mail: jiangkeyong@qdio.ac.cn

Jan. 12, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.41271547,41401644; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No.XDA05010400]

(本文编辑: 谭雪静)