4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

马 静, 王海漩, 李思瑾, 何 慧, 胡凝珠, 胡云章

(1. 昆明医科大学, 昆明650500; 2. 中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明 650118)

4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

马 静1,2, 王海漩2, 李思瑾2, 何 慧2, 胡凝珠2, 胡云章2

(1. 昆明医科大学, 昆明650500; 2. 中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明 650118)

目的 研究4-苯基咪唑(4-PI)+氢氧化铝[Al(OH)3]复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法 实验设置7个分组，分别是: 阴性对照组(1×PBS)，铝佐剂组[HepA-l+Al(OH)3], 疫苗组(HepA-l), M1[HepA-l+Al(OH)3+4-PI 500 μg]组，M2[HepA-l+Al(OH)3+ 4-PI 1 mg]组，M3[HepA-l+Al(OH)3+4-PI 1.5 mg]组和M4(HepA-l+4-PI 1 mg)组, 200 μL HepA-l, 24 μL Al(OH)3，随机分配小鼠，7只/组，分别皮下注射300 μL，接种一次。用间接酶联免疫吸附法测试抗-甲型肝炎病毒(HAV) IgG抗体滴度，检测时间为免疫后4周、8周、12周、16周。实验过程中, 观察和记录小鼠的健康情况。结果 除阴性对照组, 其余各组4个时间点均检测到抗-HAV IgG抗体，12周达到峰值。M2组在整个检测阶段抗体水平最高，显著高于疫苗组(t=4.449、3.633、2.565、6.809，P＜0.05)和M4组(t=6.256、4.796、4.153、4.113，P＜0.05)，且第4周高于铝佐组(t=2.877, P＜0.05); M4组在4个时间点检测到的抗体水平与疫苗组相当。4-PI最佳剂量组是1 mg/只。实验全程观察到小鼠每项生理指标均正常。结论 4-PI+氢氧化铝复合佐剂能增强HepA-l诱导的小鼠体液免疫应答，有望开发成HepA-l新型复合佐剂。

4-苯基咪唑(4-PI); 氢氧化铝; 佐剂; 甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l); 体液免疫

4-苯基咪唑(4-Phenylimidazole, 4-PI, 结构如图1)是一种类白色-淡黄色粉末化合物，生物化学中血红素的配体, 常用于合成、筛选小分子酶制剂。1989年Sono等[1]研究表明, 它可以与吲哚胺-2,3双加氧酶(Indoleamin-2,3 dioxygenase, IDO, 1.13.11.52)活性部位的血铁红素结合，降低该酶活性，是IDO较弱的非竞争性抑制剂。

吲哚胺-2,3双加氧酶存在于人、动物肝脏外组织中, 主要表达在抗原提呈细胞(APC)、树突状细胞(DC)上, 催化色氨酸分解成犬尿酸代谢产物[2]，是重要的免疫反馈调节分子。炎症环境中，IDO被脂多糖(LPS)、γ干扰素(INF-γ)诱导过表达，大量分解色氨酸, 使效应T细胞停止增殖、分化[3,4], 阻止促炎症因子白介素-6释放, 诱导细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)对特异性抗原无应答反应[5,6],增强辅助调节性T细胞(Treg)作用[7]，介导免疫抑制。研究表明, IDO可能与肝炎病毒复制、肝细胞损伤程度、肝癌复发转移密切相关[8,9]，甚至影响肝炎疫苗的接种效果[10]。慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者肝脏中IDO的表达大幅上升[11]，乙型肝炎病毒(HBV)感染者体内IDO mRNA量、蛋白量及活性与病毒载量呈正相关，与特异性T细胞数呈负相关。T细胞增殖被抑制，病毒逐渐扩散、感染向慢性化发展[12]。IDO还抑制肝炎小鼠自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞触发的过激免疫应答[13], 敲除该基因，小鼠产生了针对HBV表面抗原的特异性细胞毒性T细胞[14]。其抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)能促进机体对丙型肝炎病毒的免疫应答，改善肝脏的炎症和纤维化[15]。1-MT同样能降低HBV感染小鼠体内IDO的活性，恢复T细胞活化增殖，减轻肝脏损伤[16]。以上研究说明IDO参与肝炎疾病的发展过程，抑制该酶活性有助于治愈这类疾病，促进疫苗的接种，IDO抑制剂具有佐剂的研究价值，有望成为肝炎控制与治疗的新方法。

图 1 4-PI结构图Figure 1 Structure of 4-phenylimidazole

4-PI(IC50=48 μmol/L)结构简单易合成、溶解，价格便宜安全性好。2006年Sugimoto等[17]提出IDO三维晶体结构图,揭示4-PI非竞争性地结合IDO, 减少色氨酸分解, 恢复T细胞增殖分化的作用原理。研究者[18,19]通过不断修饰4-PI, 证明该类化合物能有效降低IDO活性，可将其与Al(OH)3联合,探究在HepA-l中的佐剂效果。本实验用甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)、Al(OH)3和不同剂量4-PI三者混合免疫小鼠, 分析4-PI+Al(OH)3复合物对小鼠体液免疫应答的影响, 以此评价该复合物的佐剂效果。

1 材料与方法

1.1 疫苗和抗原

昆明医学生物学研究所提供HepA-l，其甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度为256 EU/mL和甲型肝炎抗原，为纯化的甲型肝炎病毒颗粒。

1.2 实验动物

清洁级雌性ICR小鼠共49只, 5～7周龄, 体质量18～22 g, 由昆明医学生物学研究所小动物试验部提供[SCXK(滇)K2014-0002]。实行的全部实验流程严格遵照昆明医学生物学研究所动物实验伦理委员会的要求。并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.3 主要试剂

ELISA Kit(抗小鼠ABT System)购自美国KPL公司; 4-PI购自西格玛奥德里上海贸易有限公司(CAS号: 670-95-1); 铝佐剂[Al(OH)3胶体, 12.5 mg/mL]由昆明医学生物学研究所提供。

1.4 方法

1.4.1 1×PBS溶液配制 电子天平称取0.2 g KCl、8 g NaCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4, 800 mL蒸馏水溶解, 盐酸调节pH至7.4, 蒸馏水定容至1 L，高压灭菌20 min，室温保存。实验中各组的缓冲体系均用1×PBS。

1.4.2 动物分组及免疫 49只ICR雌性小鼠随机分作7组, 7只/组。将4-PI 500 μg、1 mg、1.5 mg分别与HepA-l(200 μL)、Al(OH)3(24 μL)混合, 设置为M1、M2、M3组, 同时将4-PI 1 mg与HepA-l (200 μL)混合设置为M4组，阴性组(1×PBS)、铝佐组[HepA-l+ Al(OH)3]、疫苗组(HepA-l)作为对照，每只小鼠皮下注射300 μL。于免疫后4周、8周、12周、16周采取小鼠尾静脉血约100 μL/只，鼠血37 ℃放置50 min，4 ℃静置3 h后分离血清，待检测抗体滴度。

1.4.3 ELISA试剂盒测试抗体水平 按操作说明，用间接酶联免疫吸附法测试特异性抗-HAV IgG抗体滴度。第一步包被抗原: 1×包被液混合甲型肝炎抗原包被96孔板, 100 μL/孔，4 ℃冰箱放置过夜;第二步封闭: 1×小牛血清(BSA)封闭, 200 μL/孔，37 ℃孵箱放置1 h; 第三步加一抗: 1×洗液洗板3次, 间隔5 min浸泡/次，洗板结束，加入倍比稀释的各组小鼠血清，100 μL/孔，37 ℃孵箱孵育1 h; 第四步加二抗：重复洗板3次后，每孔加100 μL用辣根过氧化酶标记、1×BSA按1∶400稀释的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵箱孵育1 h; 第五步显色: 1×洗液重复洗板3次后, 加四甲基联苯胺(TMB)显色10 min，显色液100 μL/孔; 第六步终止: 2 mol/L硫酸终止显色, 100 μL /孔; 第七步定量检测: 用双波长法在酶标仪405和655 nm波长处测试每孔吸光度(A)值, 待测血清的抗体效价是出现阳性反应的最大稀释度, 根据ELISA结果对组内每只小鼠的滴度取几何平均数, 数据用Log10的形式表示。

1.5 安全性试验

在实验期内，观察和记录小鼠的体质量、饮食、毛色是否有变化，注射部位有无病变发生。

1.6 统计分析

利用Graphpad prism 5软件分析数据的差异性,两组之间进行t检验, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗体水平检测

除1×PBS免疫的小鼠, 其它各组均检测到抗-HAV IgG抗体, 且都呈先上升后下降的趋势, 最大值在第12周达到。4周、8周、16周, M1组的抗体水平比疫苗组高(t=3.225、2.513、3.782, P＜0.05), 4周、12周比M4组高(t=5.326、4.4, P＜0.05)。M2组在每个检测时间段，检测到的抗体滴度均最高，与疫苗组(t=4.449、3.633、2.565、6.809, P＜0.05)和M4组(t=6.256、4.796、4.153、4.113, P＜0.05)比较, 差异都有统计学意义; 和铝佐组对比, 抗体滴度的差异在第4周有统计学意义(t=2.877, P＜0.05)。16周M3与疫苗组小鼠IgG水平比较差异有统计学意义(t=2.529, P＜0.05), 12周M3组抗体水平比M4组高(t=4.477, P＜0.05)。M4组检测全程抗体水平与疫苗组相当。铝佐组抗体滴度比M4组和疫苗组高(t=3.956、2.313/2.355、4.279, P＜0.05), 有统计学差异的时间在第12周、16周(图2)。4-PI 1 mg/只是目前动物实验中体液免疫增强效果最佳的剂量。

2.2 安全性评价

实验过程中，每只小鼠体质量、毛色、饮食没有异常变化，未发生痉挛、水肿、休克等病理现象，注射部位无结节、红肿。说明4-PI在目前实验剂量下较为安全。

图 2 4个检测时间点每组血清抗-HAV IgG水平Figure 2 Anti-HAV IgGs in serum of each group at four detecting time points

3 讨论

传统佐剂利用协同抗原进一步激发机体炎症反应，作为参与免疫应答中某些受体分子的激动剂，是内源危险信号因子等机制从正面改善新型疫苗在免疫原性、靶向性上的缺陷[20], 促进人体的免疫应答水平，但效果不够明显, 且副作用较多。铝佐剂是现今使用最广泛的佐剂，可用于人，安全、低成本，但诱导的黏膜反应、细胞免疫应答不足，且注射部位易引起结节、红肿[21]。IDO的发现，为新型佐剂的研发带了新的思路，它增强肝炎病毒复制，加剧肝细胞损伤，抑制T细胞免疫功能[15],还介导肿瘤免疫逃逸[22], 因此其抑制剂不仅用于提高免疫接种及化学治疗的疗效[23]，还被广泛用在肿瘤免疫治疗[24]。IDO抑制剂联合Al(OH)3, 可以从免疫调节的正反两方面，提高机体的免疫应答水平。

本实验将不同剂量IDO抑制剂4-PI与HepA-l、Al(OH)3混合免疫小鼠，探讨4-PI+Al(OH)3复合物对小鼠体液免疫的影响。实验结果表明，复合佐剂各组小鼠抗体水平明显提高，且均能持续一段时间，M2组在整个实验过程中产生的抗体水平最高，高于铝佐组，安全性良好。单纯4-PI M4组抗体水平与抗原组相当，免疫增强作用不够显著，可能与其抑制力弱，实验样本量少有关，需增设单一4-PI、复合佐剂更多剂量分组，增加HepA-l用量或改变免疫方式等来进一步判断4-PI的佐剂效应和复合佐剂能否替代铝佐剂; M4组抗体水平较铝佐组降低快，可初步说明4-PI免疫刺激持续时间比Al(OH)3短，原因是4-PI降低IDO活性短时快速，Al(OH)3则通过仓储效应缓慢释放抗原, 产生持续免疫刺激。该判断会在后续实验中进一步验证。根据昆明医学生物学研究所王陈芸等[25]研究, 用本所提供的HepA-l皮下免疫小鼠后在4周、8周、12周、16周4个检测时间点，正常抗体效价变化规律为:抗体水平随时间延长逐渐升高, 于第8周达到峰值,维持较长时间后逐渐下降。龙润乡等[26]用聚乳酸/乙醇酸包裹HepA-l口服免疫猕猴，第3周检测到抗-HAV IgG, 5～6周达到峰值，随后逐渐下降，15周加强免疫一次后，抗体水平回升。两实验中抗-HAV IgG效价变化的差异与动物模型、免疫方式、HepA-l用量有关。本实验各组抗体效价变化趋势和前人的研究一致，最大值在12周达到，并能维持一定时间。后续将重复实验、增加检测时间点进一步说明抗体效价的变化趋势。

实验组抗体水平的变化初步证明4-PI+Al(OH)3复合佐剂的有效性, 其作用机制可解释为在HepA-l诱导的炎症环境中，Al(OH)3缓慢释放抗原，持续刺激免疫，4-PI不断降低IDO对免疫的抑制，二者结合从正反两面增强体液免疫应答，提高抗体水平。研究发现在4-PI苯环2位连接一个羟基(-OH)，或3位、4位分别连接一个巯基(-SH)，合成的衍生物对IDO的抑制能力明显增加[18]。后续实验将在继续验证该复合物增强免疫有效性、单一4-PI佐剂效应的基础上，尝试检测抑制力更强、更安全的4-PI衍生物+Al(OH)3复合物的佐剂效果，探讨该类复合佐剂增强免疫的机制，期望能筛选出更安全有效的疫苗佐剂。

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Impact of 4-Phenylimidazole Combined with Aluminum Hydroxide on Humoral Immune Response Induced by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine in Mice

MA Jing1,2,WANG Hai-xuan2, LI Si-jin2, HE Hui2, HU Ning-zhu2, HU Yun-zhang2
(1. Kunming Medical University, Kunming 650500, China; 2. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo investigate the impact of 4-phenylimidazole(4-PI) combining with aluminum hydroxide as an immunological adjuvant on humoral immune response in mice immunized with live hepatitis A virus (HAV) attenuated live vaccine (HepA-1).MethodsSeven experiment groups are set up, with 7 ICR mice per group randomly. Use 1×phosphate buffer saline as negative control group, aluminum adjuvant group (HepA-1 200 μL+Al(OH)324 μL), antigen group (HepA-1), M4 (HepA-1+4-PI 1 mg) as control, in which mice were injected subcutaneously with 300 μL, immunizing one time. The mice of three groups (M1, M2, M3) were immunized with live hepatitis A vaccine HepA-1 mixed with aluminum hydroxide,4-PI at concentrations of 500 μg, 1 mg, 1.5 mg respectively. The anti-HAV specific IgG antibody levels were tested by indirect ELISA method in the serum of mice after the first 4th, 8th, 12th, 16th week of injection. The health condition of mice were observed and record during the whole study.ResultsHAV-specific IgG levels of all mice were detected at four setting time point except negative control group and reached the maximum at 12th week. The IgG titers of group M2 mice were the highest at all detected time point and showed significant difference with those of antigen group (t=4.449, 3.633, 2.565, 6.809; P＜0.05), group M4 (t=6.256,4.796, 4.153, 4.113; P＜0.05) and aluminum group at 4th week (t=2.877, P＜0.05). The IgGs induced by group M4 was comparable to the antigen group in each test phase. The optimal dosage of 4-PI was 1 mg for each mouse. The physiological indexes in all the groups of mice was normal during the course of experiment.Conclusions The humoral immune responses induced by HepA-l in mice was heightened by 4-PI combined with aluminum hydroxide,which had potential for developing a novel and compound HepA-1 adjuvant.

4-Phenylimidazole(4-PI); Aluminum hydroxide; Adjuvant; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-1); Humoral immune

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0102-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.004

2017-01-16

国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01); 云南省创新团队“中国医学科学院医学生物学研究所新型疫苗佐剂应用研究省创新团队”(2011CI140);国家自然科学基金项目(31500748); 国家重点研究计划生物安全关键技术研究发重点专项(2016YFC1202300)

马 静(1989-), 女, 硕士研究生, 主要从事疫苗佐剂方面的研究。E-mail: 1058085414@qq.com

胡云章(1962-), 男, 教授, 博士生导师, 主要从事病毒疫苗方面的研究。

E-mail: huyunzhangym@126.com