肠道病毒71型体外感染树鼩肾细胞特性观察

王文广, 匡德宣, 尹博文, 陆彩霞, 罕园园, 李 娜, 仝品芬, 孙晓梅, 蔡路奎, 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队, 昆明650118)

肠道病毒71型体外感染树鼩肾细胞特性观察

王文广, 匡德宣, 尹博文, 陆彩霞, 罕园园, 李 娜, 仝品芬, 孙晓梅, 蔡路奎, 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队, 昆明650118)

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性。方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞，观察细胞形态并进行传代培养，利用细胞角蛋白18 对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定。用EV71感染树鼩肾细胞，通过倒置显微镜观察细胞病变情况，结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况，采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量，以Vero细胞为对照，研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况。结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞，并可进行多次传代培养，细胞为梭形，贴壁呈铺路石状，免疫荧光鉴定为肾上皮细胞。EV71可以感染树鼩肾细胞，使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变，免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布，实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL，病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似。结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞，该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台。

树鼩; 肾细胞; 肠道病毒71型(EV71)

肠道病毒71型(EV71)为引起儿童手足口病主要病原体之一, 可使重症患儿出现肺水肿、脑炎等症状，严重危害婴幼儿生命和健康[1]。树鼩作为一种新型实验动物，在复制人类疾病和药物评价应用中独具优势，近年来在生物医学研究领域，尤其是病毒学方面受到越来越多的重视。研究表明[2]，幼龄中缅树鼩(Tupaia belangeri chinensis)可以感染EV71，表现出一系列与人相似的临床症状，有望成为一种新的手足口病动物模型而被应用于EV71的基础或临床研究，而建立树鼩细胞水平的感染模型不仅能对上述研究进一步补充完善, 更能为EV71的感染机制研究和药物筛选评价提供新的实验平台。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞), 是目前公认的一种良好的病毒培养载体[3,4], 本研究以此细胞为对照,通过对树鼩肾细胞的分离培养和EV71感染实验, 初步探讨建立EV71感染树鼩肾细胞模型的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 经人工繁育的F1代成年中缅树鼩，来自中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇) K2013-0001], 饲养于本中心普通级环境中的树鼩专用不锈钢笼具内[SYXK(滇) K2013-0001]。

1.1.2 细胞和病毒 Vero细胞和EV71标准毒株(FY-23), 均来自中国医学科学院医学生物学研究所。1.1.3 主要仪器 日立台式离心机(CT15RE，日本日立公司)，实时荧光定量PCR仪(CFX 96，美国BIO-RAD公司), 尼康倒置荧光显微镜(ECLIPSE, 日本尼康公司), 二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)。

1.1.4 主要试剂 DMEM培养基、 质量分数0.25%胰蛋白酶溶液、双抗(美国HyClone公司)，胎牛血清(美国BI公司)，细胞角蛋白18抗体(美国Abcam公司)，肠道病毒EV71抗体(美国Millipore公司)，荧光标记的兔抗鼠IgG(德国Merck公司)，RNAiso Plus(D9108A), 实时定量RT-PCR试剂(DRR064A)(大连宝生物公司), 引物探针均由大连宝生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 树鼩肾细胞的原代培养 选F1代成年树鼩脱颈处死，无菌取肾，剔除包膜，用含体积分数1%双抗的PBS反复冲洗干净；取肾皮质部分，剪成1 mm3组织小块，用含1%双抗的PBS反复冲洗，并吸弃上清; 用眼科镊结合加样枪将组织块分散布入25 cm2培养瓶中。翻转培养瓶，加入3 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，于二氧化碳培养箱中(37 ℃, 体积分数5% CO2)倒置培养1～2 h,然后轻轻翻转正置培养。培养期间根据生长情况更换培养液，使用倒置显微镜观察并拍照。

1.2.2 树鼩肾细胞的传代培养 对从组织块周围迁出且铺满瓶底80%左右面积的原代肾细胞进行首次传代培养, 加质量分数0.25%胰酶消化并按照1∶2进行传代培养，定期观察并拍照。

1.2.3 树鼩肾细胞细胞免疫荧光鉴定 树鼩肾细胞接种至6孔板，待其80%铺满孔底后，PBS 清洗2次，使用质量分数4%多聚甲醛溶液固定20 min; PBS 清洗3次，质量分数0.5%的Triton-X100穿孔15 min; PBS 漂洗3次, 山羊血清封闭液封闭30 min, PBS 漂洗3次，加入质量分数3% BSA 稀释的小鼠角蛋白18单克隆一抗(1∶200)，4 ℃过夜; PBS漂洗3次，加入1%BSA 稀释的荧光标记的兔抗鼠IgG(1∶200)，37℃避光孵育1; 暗光环境中，PBS漂洗3次，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min，对标本进行染核; PBS 漂洗3次，洗去多余的DAPI; 在荧光显微镜下进行观察。

1.2.4 EV71感染实验 选择贴壁完全的树鼩肾细胞，以质量分数0.25%胰酶消化后制备密度为5× 104/mL的细胞悬液, 按每孔2 mL接入12孔板, 待形成细胞单层(90%铺满瓶底)，吸弃培养液，PBS冲洗细胞单层，分别按10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50接种EV71病毒0.1 mL，同设空白对照, 培养基为不含血清的DMEM培养液, 培养期间定期进行观察拍照, 使用EV71抗体按照1.2.3步骤进行免疫荧光观察, 以质量分数Vero细胞作对照进行同样处理。

1.2.5 EV71培养物的采集 选择贴壁完全的树鼩肾细胞, 质量分数以0.25%胰酶消化后制备密度为5× 104/mL的细胞悬液, 按每孔1 mL接入24孔板, 待细胞贴壁形成90%单层, 以PBS冲洗后按100 TCID50每孔接种EV71病毒0.05 mL，无血清DMEM培养，分别在接种后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h收集病毒培养上清，待测病毒载量，以Vero细胞作对照进行同样处理。

1.2.6 病毒增殖曲线 Trizol法提取病毒培养上清中RNA，按宝生物试剂盒DRR064A说明进行实时RT-PCR操作, 根据不同时间点病毒的载量绘制增殖曲线。定量标准品稀释梯度为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL,引物探针根据EV71(FY-23)基因序列保守区设计:

上游引物: 5'-CGCTTTGACGCAGAGTTCACT-3';

下游引物: 5'-TTGGAGCAATTGTGGGACGA-3';

探针: 5'-FAM-TTGTTGCGTGCACACCCACCG-BHQ1-3'。

2 结果

2.1 树鼩肾细胞原代培养

在倒置相差显微镜下观察, 经原代培养2～3 d可见树鼩肾组织块附近有细胞迁出，5 d左右可见密集的单层贴壁细胞(图1), 细胞形态以梭形为主，排列紧凑，与Vero细胞相似，贴壁呈铺路石状。

2.2 树鼩肾细胞传代培养

树鼩原代肾细胞37 ℃培养5 d左右基本可以铺满瓶底，可用质量分数0.25%胰酶消化进行细胞的第一次传代。树鼩原代肾细胞细胞可以连续进行多次传代培养(图2)，细胞能够保持旺盛活力，2～3 d即可铺满瓶底，细胞形态逐渐均一，紧密贴壁呈现出明显的铺路石状。

2.3 树鼩肾细胞免疫荧光鉴定

培养的树鼩肾细胞用角蛋白18单抗进行免疫荧光鉴定，普遍呈阳性反应(图3)，阳性比例达到95%以上，鉴定结果与Vero细胞一致，可以认定为树鼩肾上皮细胞。

2.4 EV71对树鼩肾细胞的感染情况

图 1 树鼩原代肾细胞形态Figure 1 Morphology of primary kidney cells in tree shrews

图 2 树鼩肾细胞传代培养形态Figure 2 Subculture morphology of tree shrews kidney cells

图 3 树鼩肾细胞免疫荧光鉴定Figure 3 Immunofluorescence identification of kidney cells in tree shrews

图 4 EV71感染树鼩第3代肾细胞Figure 4 The third generation kidney cells of tree shrew infected with EV71

图 5 EV71感染Vero细胞Figure 5 Vero cells infected with EV71

图 6 EV71感染树鼩肾细胞的免疫荧光观察Figure 6 Immunofluorescence observation on kidney cells of tree shrew infected with EV71

分别采用10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50三个剂量的EV71病毒感染第3代树鼩肾细胞，定期在倒置显微镜下观察病变情况。结果显示，接种EV71病毒12 h后，100 TCID50和1 000 TCID50两个剂量组的树鼩肾细胞单层开始由紧密变得稀疏,少量细胞变圆，脱落, 其中病变情况以1 000 TCID50剂量组较为明显; 接种病毒24 h后，可见明显细胞变圆、漂浮和脱落，细胞单层逐步解体; 接种病毒48 h后，细胞绝大部分都已病变、解体，基本观察不到完整的细胞形态。10 TCID50剂量组在接种后的48 h才开始出现少量的细胞变圆脱落，整个感染进程相对缓慢。以100 TCID50感染剂量组来做比较，树鼩第3代肾细胞病变情况与进度(图4)与Vero细胞(图5)大致相似。

通过免疫荧光实验可以观察到EV71病毒蛋白在树鼩肾细胞上的表达情况(图6), 接种病毒6 h开始有少量病毒蛋白出现, 12 h后可以观察到病毒蛋白增多,分布在细胞质中靠近细胞核的部位, 24 h即可观察到更为密集的病毒蛋白, 48 h病毒蛋白遍布整个视野,病毒在树鼩肾细胞上的增殖趋势与Vero细胞一致。

2.5 病毒增殖曲线

采用实时荧光定量PCR的方法连续检测EV71病毒RNA在树鼩肾细胞上的复制情况，从病毒增殖曲线(图7)可以看出EV71在刚接种的12 h内增殖缓慢，而在随后的24 h内快速复制，在接种48 h前后达到峰值，病毒载量最高可达105拷贝/mL以上。EV71在树鼩肾细胞上的增殖情况稍弱于Vero细胞，但两者大致趋势相似。

图 7 EV71感染树鼩肾细胞的增殖曲线Figure 7 Proliferation curve of EV71 in kidney cells of tree shrew

3 讨论

树鼩作为一种新型实验动物, 由于能够成功复制多种人类疾病, 越来越受到科研人员重视。但由于树鼩标准化程度不高、个体间差异较大等因素,其疾病模型的可重复性和稳定性均存在问题, 在一定程度上影响实验结果判定。相对而言, 细胞感染模型能较好地避免或减少个体差异的干扰，可以对体内感染模型起到补充验证作用, 而且在细胞水平上可以很方便地开展病毒感染规律与入侵机制的研究, 还能为药物筛选等研究提供体外实验平台。许多研究证实[5,6]树鼩可感染人乙型肝炎病毒(HBV), 而其感染机制的突破则更多是借助细胞平台实现的, 比如HBV关键受体牛黄胆酸钠共转移多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)就是在树鼩原代肝细胞感染实验中发现的[7], 另有体外实验证明[8], Kupffer细胞中Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2) 和TLR4与HBV慢性化感染进程相关。

此前有研究证实[2]，EV71可感染幼龄中缅树鼩，使之表现出与人手足口病相似的症状。本研究在此基础上，尝试建立EV71感染树鼩肾细胞的体外模型，进行树鼩肾细胞的分离培养是其关键的第一步。目前常用的肾细胞分离方法有组织块贴壁培养法、胶原酶、胰蛋白酶以及两者的组合消化法和联合EDTA结合法等[9,10]。本实验初步证明，采用组织块贴壁法即可快速制备成年树鼩的原代肾细胞。实验表明，该细胞对培养条件的要求并不高，使用常规的含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基即可。由于采用了比较简单的组织块贴壁法，使得树鼩原代肾细胞成分较为复杂，但可以利用不同细胞贴壁能力的差异，通过胰酶的分步消化进行简单纯化。初步纯化后的树鼩肾细胞与Vero细胞形态十分相似，主要为梭形，传代培养2 d左右即可形成紧密的单层, 表现出典型的铺路石状。通过间接免疫荧光实验可以看到，本实验所分离培养的树鼩肾细胞普遍表现出角蛋白18阳性,可以认定为肾上皮细胞。树鼩肾细胞可以进行多次传代，传代3次后的细胞仍能保持均一的细胞形态和旺盛的细胞活力，这就为后续的病毒感染实验奠定了基础。

以100 TCID50的EV71病毒感染树鼩肾细胞，2 d左右可在显微镜下观察到明显的细胞变圆、脱落和解体等病变，间接免疫荧光观察可见病毒蛋白在树鼩肾细胞中的表达情况，病毒载量最高可达105拷贝/mL以上，其细胞病变情况和病毒感染进程与Vero细胞大致相似，这些实验数据证明EV71可以感染树鼩肾细胞，也意味着建立EV71感染树鼩肾细胞的体外实验模型是可行的。综合细胞病变情况和病毒载量增殖趋势，在接种EV71病毒后的12 h内，细胞尚未明显的病变，病毒载量也保持较低水平，表明病毒接种后有一个适应期，而在这个阶段病毒如何入侵树鼩肾细胞、结合了哪些关键受体，这些科学问题或将可以依靠此细胞感染模型得以深入探讨。

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Study on Infectivity of EV71 in Kidney Cells of Tree Shrew

WANG Wen-guang, KUANG De-xuan, YIN Bo-wen, LU Cai-xia, HAN Yuan-yuan, LI Na, TONG Pin-fen, SUN Xiao-mei, CAI Lu-kui, DAI Jie-jie
(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Yunnan Innovation Team of Standardization and Application Research in Tree Shrew, Kunming 650118 China)

ObjectiveTo investigate enterovirus 71 (EV71) infection characters on the tree shrew kidney cells.MethodsThe primary kidney cells from tree shrew were isolated by tissue culture. The cell was passaged and morphology was observed regularly. The indirect immunofluorescence identification was performed by using keratin 18. Tree shrew kidney cells were infected with EV71, cell lesions were observed by inverted microscope, viral load was detected by real-time PCR. Vero cells were used as control.ResultsTree shrew primary kidney cells can be rapidly prepared by tissue culture and can be passaged easily. The kidney cells are mainly spindle-shaped and show paving - stones structure after adherent. They were identified as kidney epithelial cell by immunofluorescence assay. Tree shrew kidney cells can be infect with EV71 and showed significant cytopathic effect (CPE) such as rounding, falling off and lysis. The viral protein was observed by immunofluorescence. Viral load of was up to 105copies/mL. The CPE and proliferation trends were similar to that of Vero cell.ConclusionEV71 can infect tree shrew kidney cells under in vitro condition, and the cell assay can provide a platform for drug screening and infection mechanism research of EV71.

Tree shrew; Kidney cells; Enterovirus 71

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0123-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.008

2016-12-05

国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01); 云南省联合支持国家计划项目(2015GA009)

王文广(1985-), 男, 助理研究员, 硕士, 研究方向: 人类疾病动物模型。E-mail: windgoon@foxmail.com

代解杰(1961-), 男, 研究员, 博士生导师。E-mail: djj@imbcams.com.cn