氢气对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤内质网应激及神经细胞凋亡的影响*

夏裕宁，李雪梅，袁楠楠，张鑫磊，谭永星

(桂林医学院：1.研究生院；2.附属医院护理部；3.附属医院重症医学科，广西桂林 541001)

·论 著·

氢气对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤内质网应激及神经细胞凋亡的影响*

夏裕宁1，李雪梅2，袁楠楠1，张鑫磊1，谭永星3△

(桂林医学院：1.研究生院；2.附属医院护理部；3.附属医院重症医学科，广西桂林 541001)

[摘要] 目的 探讨吸入高浓度氢气(H2)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(IRI)内质网应激(ERS)相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)及脑皮质神经细胞凋亡和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。方法 选取72只健康成年SPF级雄性SD大鼠，将其分为对照组(Ⅰ组：不作任何处理)、假手术组(Ⅱ组)、脑IRI组(Ⅲ组)、氢气治疗组(Ⅳ组)，每组18只。采用线栓法建立大鼠局灶性脑IRI模型。于再灌注24 h后行神经功能缺损评分(NDS)，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察大鼠脑缺血梗死程度并计算脑梗死面积，原位末端标记法(TUNEL)技术检测各组大鼠脑皮质神经细胞凋亡并计算凋亡指数(AI)，Western blot法和免疫组织化学法检测大鼠脑皮质GRP78、Caspase-12、Bcl-2及Bax蛋白表达。结果 与Ⅰ、Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组大鼠脑IRI后NDS、脑梗死面积、AI均明显增加，GRP78、Caspase-12、Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05)；与Ⅲ组比较，Ⅳ组大鼠NDS、脑梗死面积、AI及Caspase-12、Bax蛋白表达明显减少，GRP78、Bcl-2表达明显增加(P<0.05)。结论 再灌注同时吸入高浓度H2可通过增加脑IRI后内质网GRP78蛋白表达，并抑制Caspase-12的激活进而抑制ERS并促进内质网功能修复，对大鼠脑IRI起到一定的保护作用。

氢；脑缺血；再灌注损伤；细胞凋亡；内质网；应激

脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是临床常见的具有严重危害的病生过程，是包括多种作用机制在内的一种复杂的综合征[1]。缺血及再灌注所引起的缺氧、能量耗竭、酸中毒、钙稳态的破坏及大量自由基的生成等均可诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，细胞可通过ERS自身产生应激性保护作用；但是过强或持久的ERS会激活凋亡信号通路，引起细胞凋亡，加重脑IRI。Ishige等[2]研究表明，ERS在脑IRI过程中处于中心环节，可启动神经细胞凋亡途径。Tian等[3]研究证实，氢气(H2)可有效降低脑IRI，但H2与脑IRI后ERS的关系尚不清楚。本研究通过建立大鼠局灶性脑IRI模型，通过观察IRI后脑皮质神经细胞凋亡及ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化，探讨吸入高浓度H2对脑IRI内质网应激及神经细胞凋亡的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：健康雄性SD大鼠72只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪2012-0002)，体质量为(210±10)g。(2)试剂及仪器：原位末端标记法(TUNEL)凋亡检测试剂盒(罗氏公司，瑞士)；兔单克隆抗GRP78、Bcl-2(Abcam 公司，英国)；兔多克隆抗Caspase-12、Bax(Abcam 公司，英国)；单克隆抗体β-actin(Santa Cruz 公司，美国)；即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒(鼠/兔)(福州迈新生物技术开发有限公司，中国)；辣根酶标记山羊抗兔、小鼠(中山金桥有限生物公司，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；DAB显色试剂盒(Sigma公司，美国)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(国药集团化学试剂有限公司，中国)；H2浓度检测仪检测(日本新宇宙，型号XP-3140，日本)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将72只大鼠按随机数字表法分为4组：对照组(Ⅰ组，不做任何处理)，假手术组(Ⅱ组，只分离颈动脉即予缝合，同时吸入67%N2+33%O2混合气体)，脑IRI组(Ⅲ组，脑缺血1 h再灌注24 h，同时吸入67%N2+33%O2混合气体)，氢气治疗组(Ⅳ组，于脑缺血1 h再灌注同时吸入67% H2+33%O2混合气体2 h，并每间隔6 h予以吸入H22 h)，每组18只。Ⅱ组与Ⅲ组每次吸气时间及间隔时间与Ⅳ组相同。

1.2.2 高浓度H2制备及检测 使用氢氧气雾化机(上海潓美医疗科技有限公司，型号AMS-H-01)产氢，电解纯水后H2与O2比例为2∶1。将大鼠放入密封的带有进气口和出气口的树脂玻璃箱子内，通过气体流量计将H2和O2混合后从进气口输入箱内，残余气体从出气口排出。混合气中H2浓度使用H2浓度检测仪监测(日本新宇宙，型号XP-3140)。

1.2.3 动物模型制备及处理 参照Zea-Longa的线栓法并加以改良制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。栓线采用直径0.24～0.26 mm，长4.00 cm 的尼龙线(北京西浓科技有限公司，中国)。用4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈旁正中切口，分离并暴露左侧颈总动脉及颈内外动脉。结扎左侧颈外动脉根部，暂时结扎左侧颈总动脉，由颈外动脉近分叉处剪一小口插人栓线，进线长度18.00～20.00 mm感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线，阻断60 min 后，拔出栓线至颈外动脉残端内进行再灌注24 h。Ⅳ组再灌注同时给予吸入67%H2+33%O2混合气体2 h，以后每间隔6 h给予以吸入H22 h；Ⅱ、Ⅲ组于再灌注同时吸入67%N2+33%O2混合气体，每次吸气时间及间隔时间与Ⅳ组相同。Ⅱ组只分离颈动脉但不予结扎。围术期间采取严格消毒措施，恒温毯维持大鼠体温在37 ℃左右。

1.2.4 神经功能缺损(NDS)评分 各组大鼠于再灌注24 h后及相应时间点参考Longa的5级4分法行NDS评分。0分：行走正常，无神经损伤症状；1分：垂直提尾时大鼠右前肢不能完全伸展；2分：大鼠行走时向右侧转圈；3分：大鼠行走时向右侧跌倒；4分：不能自发行走，意识水平明显下降。1～3分即为制模成功。

1.2.5 TTC染色测定脑梗死面积 于再灌注24 h后，每组各取6只大鼠，用4%水合氯醛麻醉后断头取脑。迅速将脑组织置于-20 ℃中速冻20 min后取出，除去额端1.00 mm左右，由前向后每隔2.00 mm作冠状切片，均匀切成5片。置于2%TTC液中，放入37 ℃恒温箱中避光孵育30 min，每隔15 min翻面使脑组织均匀染色。染色后可见正常脑组织呈红色，梗死灶染成白色。将染色后的脑组织用4%多聚甲醛溶液再次固定48 h，数码相机拍照并利用ImageJ软件分析计算梗死面积，计算得梗死面积百分比=(梗死面积/整个脑组织面积)×100%。

1.2.6 TUNEL法检测脑皮质区凋亡神经细胞 于再灌注24 h后，每组取6只大鼠，麻醉后用冰生理盐水心脏灌注，断头取脑，取部分缺血侧皮质区组织于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余部分置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。采用漂片法25 μm冰冻切片行细胞凋亡检测。应用TUNEL 试剂盒检测各组大鼠脑皮质原位神经元的凋亡情况，严格按照试剂盒操作说明进行检测。TUNEL染色结束后，滴加DAPI(1∶1 000)孵育5 min，抗荧光猝灭剂封片，采用Olympus荧光显微镜(Olympus公司)观察并拍照。镜下观察红色荧光为TUNEL 阳性细胞，蓝色荧光为DAPI对所有细胞核进行染色。取5个不重复视野(×200)，计数细胞总数和TUNEL 染色阳性细胞数，计算细胞凋亡指数(AI)。AI =(凋亡细胞数/总细胞数)×100%，采用IPP6.0分析TUNEL阳性细胞和DAPI墨迹，观察凋亡细胞与神经元的位置关系。

1.2.7 免疫组织化学染色 冰冻切片用PBS漂洗后以PBS∶甲醇∶H2O2(5∶4∶1)溶液阻断组织内源性过氧化物酶活性，1%BSA封闭1 h，按1∶200稀释一抗 Bcl-2、Bax及Caspase-12，4 ℃孵育过夜；次日滴加即用型快捷免疫组化Max Vision试剂盒(鼠/兔)试剂，室温孵育20 min，DAB染色3～5 min。操作过程按各试剂盒说明进行。光镜下观察并拍照，每张切片取5个高倍视野(×200)，对脑皮质区染色阳性细胞计数。

1.2.8 Western blot法检测 Western blot法检测脑皮质区凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及内质网应激相关蛋白GRP78、Caspase-12的表达。取备用皮质区脑组织100 mg剪碎、研磨后，加入组织裂解液提取总蛋白， BCA 试剂盒检测蛋白浓度后，蛋白变性，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转法转至PVDF膜行免疫反应后于5%脱脂奶粉室温封闭2 h，按1∶1 000稀释Bcl-2、Bax及GRP78、Caspase-12抗体，4 ℃孵育过夜，次日取出用TBST洗膜，孵育二抗1 h，再用TBST洗二抗，加ECL发光液，放入Bio-Rad凝胶成像仪中自动显影读出条带，测得各目的条带灰度值，以β-actin为内参照算得各组相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠NDS症状评分及TTC染色比较 Ⅰ、Ⅱ组的大鼠无行为学异常，行动自如，饮食正常，反应敏捷；Ⅲ组大鼠精神萎靡，食欲欠佳，行走时向右侧转圈或跌倒，反应迟钝；Ⅳ组大鼠行动较灵敏，饮食正常，行走速度较快且不转圈，反应较快，NDS评分明显低于Ⅲ组(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ组无梗死灶，Ⅲ、Ⅳ组脑缺血1 h再灌注24 h脑组织TTC染色可见明显梗死灶，但Ⅳ组梗死面积较Ⅲ组明显减少(P<0.01)，见表1、图1。

2.2 各组大鼠皮质区TUNEL染色检测细胞凋亡比较 脑皮质区荧光双标DAPI染色结果显示，Ⅰ、Ⅱ组神经元细胞核圆且大，排列紧密，几乎未见核碎片；Ⅲ组神经元胞核浓缩深染，核间隙增宽，可见较多细胞核碎片；与Ⅲ组相比，Ⅳ组细胞核较饱满，细胞核碎片较少。TUNEL染色显示，Ⅰ、Ⅱ组偶见凋亡细胞，两组凋亡细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Ⅰ、Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组脑IRI后凋亡细胞数明显增多，AI明显升高(P<0.01)；与Ⅲ组相比，Ⅳ组脑IRI后凋亡细胞减少，AI下降(P<0.01)。各组切片Merged结果显示，TUNEL染色阳性细胞与DAPI染色细胞核大致重叠，见图2、表2。

表1 各组大鼠NDS评分及皮质区梗死面积比较

a：P<0.05，与Ⅰ、Ⅱ组比较；b：P<0.05，与Ⅲ组比较。

2.3 各组大鼠脑皮质神经元GRP78、Caspase-12、Bcl-2和Bax蛋白表达比较 与Ⅰ、Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组大鼠IRI 24 h后神经元GRP78蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，Ⅲ组IRI 24 h后神经元Caspase-12和Bax蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2表达量明显降低(P<0.05)；与Ⅲ组比较，Ⅳ组IRI 24 h后神经元Caspase-12和Bax蛋白表达水平明显降低，GRP78蛋白表达量进一步升高，Bcl-2表达明显增加(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ组与Ⅳ组IRI 24 h后神经元Caspase-12、Bcl-2和Bax蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色结果

图2 各组大鼠皮质区TUNEL原位神经细胞凋亡检测结果(×200)

表2 各组大鼠AI及脑皮质GRP78、Caspase-12等的蛋白表达比较

a：P<0.05，与Ⅰ、Ⅱ组比较；b：P<0.05，与Ⅲ组比较。

图3 各组大鼠皮质区GRP78、Caspase-12等蛋白表达

2.4 各组大鼠免疫组化染色检测脑皮质Bcl-2、Bax、Caspase-12的表达比较 Ⅰ、Ⅱ组未见Bax、Caspase-12阳性细胞，而Bcl-2阳性细胞表达较多。与Ⅰ、Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组脑IRI 24 h后Bax、Caspase-12表达明显增多，Bcl-2表达明显减少(P<0.01)；与Ⅲ组比较，Ⅳ组脑IRI 24 h后Bcl-2表达明显增多，而Bax、Caspase-12表达明显减少(P<0.01)；且Ⅰ、Ⅱ组神经元Bcl-2、Bax、Caspase-12表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组大鼠脑皮质Bcl-2、Bax等表达比较

a：P<0.05，与Ⅰ、Ⅱ组比较；b：P<0.05，与Ⅲ组比较。

3 讨 论

本研究通过采用阻塞左侧大脑中动脉的方法制备大鼠局灶性脑IRI模型，并于再灌注同时给予吸入高浓度H2，通过观察大鼠神经行为学变化、脑组织形态学及神经细胞凋亡等指标观察H2对脑IRI的保护作用。实验结果表明，H2可明显降低大鼠脑IRI后NDS评分，降低IRI引起的大鼠脑梗死面积并抑制神经细胞凋亡，揭示了H2对大鼠局灶性脑IRI具有明确的保护作用，本研究结果与既往研究基本一致[3-4]。目前H2发挥神经保护作用的具体机制尚不清楚。有文献报道H2能通过调节核因子κB(NF-κB)抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化，进而有效减轻大鼠Aβ1-42 诱发的神经炎症及氧化应激，降低8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)、白细胞介素-1β(IL-1β)的水平，同时改善海马CA1细胞凋亡[5]。此外，Hong等[6]的实验表明富氢水可抑制大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)引起的神经细胞凋亡并改善其神经症状，其机制可能与通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/丝/苏氨酸蛋白激酶/糖原合成激酶(PI3K/Akt/GSK3β)信号通路发挥作用有关。鉴于以上H2抗细胞凋亡的生物学作用及脑IRI后ERS是启动细胞凋亡的一种新途径，本研究拟进一步探讨H2对脑IRI的保护作用是否与抑制ERS有关。

脑IRI发病因素包括缺血/再灌注过程中出现的ATP耗竭、活性氧自由基(ROS)增多及钙稳态的破坏等，这些因素均可导致内质网内的蛋白折叠功能受损，使未折叠和错误折叠蛋白质在内质网腔内聚集，进而引发ERS。ERS早期是细胞应答刺激的适应性反应，过强或持久的ERS可诱导细胞凋亡[7]。有研究表明，抑制过度的ERS能显著减少细胞凋亡进而抑制细胞IRI[8-9]。GRP78是ERS诱导表达的关键分子伴侣蛋白，作为ERS的标志性保护蛋白，其在蛋白质折叠、调节ERS跨膜信号蛋白的活性等方面发挥着重要作用从而改善内质网损伤[10]。有研究表明，在缺血低氧、ROS增多、热休克反应等多种应激状态下，内质网可激活细胞内的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR) ，通过激活转录因子6(ATF-6)作用于GRP78基因的启动子，上调GRP78转录活性，使其表达量增高，改善内质网功能恢复[11-12]。此外，有研究结果显示，白藜芦醇可通过增加GRP78表达，减少p-PERK和转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)表达，抑制ERS反应，从而改善脑IRI大鼠NDS评分，减少梗死体积，对脑IRI起保护作用[13]。本研究结果显示，脑IRI后神经细胞GRP78表达升高，而吸入H2后GRP78表达量进一步升高，提示了ERS参与了脑IRI过程，且H2能通过上调GRP78蛋白表达进而改善内质网功能。既往研究表明，在脑IRI过程中，ERS可激活UPR，UPR是由GRP78和双链RNA 激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、激活转录因子6(ATF-6)和肌醇需要因子1(IRE-1)所介导，PERK、ATF6和IRE-1信号不仅能够启动ERS的生存途径，而且严重或持续的ERS损伤内质网功能的同时，可启动由ERS所介导的凋亡信号通路，通过激活下游的凋亡信号分子，如CHOP、JNK、Caspase及Bcl-2家族等诱导细胞凋亡[10-13]。Caspase-12是ERS诱导凋亡途径所固有的，正常情况下其位于内质网膜上，处于无活性状态。当ERS时，Caspase-12被激活，活化后的Caspase-12从内质网转移至细胞液，进一步激活Caspase-9，最终激活凋亡执行效应分子Caspase-3，导致细胞凋亡[14]。细胞凋亡过程是由多种调节基因共同参与完成，尤其与一些原癌基因如Bcl-2 和Bax 等密切相关。研究表明促凋亡因子Bax与ERS诱导的细胞凋亡有关[15]。因此，本研究采用Caspase-12、Bcl-2和Bax反应大鼠脑IRI后神经细胞凋亡情况。

实验结果表明，TUNEL染色墨迹显示凋亡细胞与皮质区神经元基本重合，吸入高浓度H2可以明显减少大鼠脑皮质区神经细胞凋亡，同时可降低神经细胞Caspase-12及Bax蛋白表达，升高GRP78、Bcl-2蛋白表达，从而抑制ERS，对大鼠脑IRI起到明确保护作用。其机制可能是在IRI过程中神经细胞能量代谢障碍、大量ROS自由基产生增多及内质网内Ca2+稳态紊乱等综合作用下，导致内质网腔内未折叠及错误折叠蛋白大量聚集，分子伴侣蛋白GRP78即与3种内质网感应蛋白PERK、IRE1、ATF6解离,而与未折叠及错误折叠蛋白结合以协助蛋白的正确折叠，进而减轻ERS，恢复内质网的正常功能，从而减少神经细胞凋亡。因此，推测H2可能通过激活GRP78蛋白及抑制Caspase-12蛋白的表达，促进细胞未折叠及错误折叠蛋白的正确组装，抑制了ERS；同时通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达及下调促凋亡蛋白Bax的表达减少神经细胞凋亡等有关。但高浓度H2抑制脑IRI后ERS的具体调控通路及作用机制尚有待进一步深入研究。

综上所述，再灌注同时吸入高浓度H2对大鼠局灶性脑IRI可产生明确保护作用，其机制可能与H2可增加脑IRI后内质网GRP78蛋白表达并抑制Caspase-12的激活促进内质网功能修复及抑制ERS，同时通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达及下调促凋亡蛋白Bax的表达减少神经细胞凋亡等有关。

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Effect of hydrogen gas on endoplasmic reticulum stress and neural cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury*

XiaYuning1,LiXuemei2,YuanNannan1,ZhangXinlei1,TanYongxing3△

(1.PostgraduateSchool;2.DepartmentofNursing,AffiliatedHospital;3.DepartmentofIntensiveCareMedicine,AffiliatedHospital,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541001,China)

[Abstract] Objective To investigate the effects of inhaling high concentration of hydrogen gas on the expressions of endoplasmic reticulum stress(ERS) related protein glucose regulated protein 78 (GRP78),Caspase-12 and the neural cell apoptosis and related proteins Bcl-2 and Bax in the rats with focal cerebral ischemia reperfusion(I/R) injury.Methods Seventy-two healthy SPF male Sprague-Dawley rats were selected and then randomly divided into the control group(Ⅰ:without any treatment),sham operation group (Ⅱ),cerebral IRI group (Ⅲ) and hydrogen gas treatment group (Ⅳ),18 cases in each group.Focal cerebral ischemia reperfusion injury (IRI) model was induced by using the suture-occluded method.The neurological deficits score (NDS) was assessed at 24 h after cerebral reperfusion in four groups.The cerebral infarction severity and size were detected by TTC staining and neuronal apoptosis of brain cortex were tested by TUNEL technique.The apoptosis index (AI) was calculated.Then the expressions of GRP78,Caspase-12,Bcl-2 and Bax were assessed by Western blot and immunohistochemistry.Results As compared with the group Ⅰand Ⅱ,NDS score,cerebral infarction size,AI and the expressions of GRP78,Caspase-12 and Bax in cerebral cortex in the group Ⅲ and Ⅳ were significantly increased,while the expression of Bcl-2 in cerebral cortex was markedly decreased(P<0.05);compared with the group Ⅲ,NDS score,brain infarction size,AI and the expression of Caspase-12 and Bax in cerebral cortex in the group Ⅳ were markedly decreased,while the expressions of GRP78 and Bcl-2 were dramatically increased (P<0.05).Conclusion Inhaling high concentration of hydrogen gas has a certain protective effect on cerebral IRI in rats through increasing endoplasmic reticulum GRP78 protein expression after IRI and inhibiting Caspase-12 activation,thus inhibiting ERS and promoting the repair function of endoplasmic reticulum.

hydrogen;brain ischemia;reperfusion injury;apoptosis;endoplasmic reticulum;stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.003

国家自然科学基金资助项目(81260206)；广西壮族自治区自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019155，2015GXNSFAA139130)；广西壮族自治区卫生厅课题(Z2009038，Z2013497，Z2012402)；广西医学科学实验中心开放课题(KFJJ2011-07)。 作者简介：夏裕宁(1987-),在读硕士研究生,主要从事围术期脏器功能保护的基础与临床研究。△

，E-mail:tanyongxing24@163．com。

R743.31

A

1671-8348(2017)09-1159-04

2016-07-18

2016-11-16)