载氯诺昔康壳聚糖关节腔注射用温敏凝胶的制备及体外释药性观察

田红，黄桂华，朱圣俊，窦明金

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250022；2山东省医学科学院附属医院；3 山东大学药学院)

·药学研究·

载氯诺昔康壳聚糖关节腔注射用温敏凝胶的制备及体外释药性观察

田红1，2，黄桂华3，朱圣俊1,2，窦明金2

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250022；2山东省医学科学院附属医院；3 山东大学药学院)

目的 制备关节腔注射用载氯诺昔康(Lnxc)壳聚糖温敏凝胶，观察其理化性质及体外释药性。方法 以壳聚糖、β-甘油磷酸钠(β-GP)为材料制备载Lnxc温敏凝胶，以胶凝温度、时间、通针性为评价指标，优化处方工艺；采用椎板法观察凝胶的流变学性质，采用离心试验、温度试验观察凝胶的稳定性，采用动态膜透析法观察载Lnxc温敏凝胶和Lnxc溶液的体外释药特性。结果 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的最佳处方为Lnxc 2 mg、3% 壳聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制备的温敏凝胶属于非牛顿流体，离心后无分层现象，4 ℃和25 ℃条件下呈流动状，37 ℃发生相变形成凝胶。Lnxc溶液8 h药物累积释放率86.70%，载Lnxc温敏凝胶72 h药物累积释放率86.41% ，释药规律符合Higuchi方程。结论 成功制备载Lnxc壳聚糖关节腔用温敏凝胶，其具有理想的胶凝温度和较好的缓释效果。

骨关节炎；氯诺昔康；壳聚糖；β-甘油磷酸钠；温敏凝胶；理化性质；释药特性

氯诺昔康(Lnxc)是治疗骨关节炎的常用药物，目前临床上应用的主要是片剂和注射剂，其半衰期为3～5 h，为达到有效血药浓度需频繁给药，患者依从性较差。温敏凝胶可作为药物的储库，具有缓慢释放药物、提高药物疗效的作用。2015年3月～2016年5月，我们以壳聚糖、β-甘油磷酸钠(β-GP)为材料制备载Lnxc关节腔注射用温敏凝胶，经优化处方工艺后观察其理化性质及体外释药性。

1 仪器与试剂

ER-182A型电子天平(日本)，AL104-IC精密分析天平(瑞士梅特勒公司)；电磁搅拌仪，HZ-8812S恒温振荡器(华利达公司)，TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；移液器(德国Eppendorf公司) ，台式 pH 计(梅特勒公司，瑞士)。壳聚糖(SIGMA-ALDRICH),β-甘油磷酸钠(β-GP，上海恒斐生物科技有限公司)，Lnxc(湖北远成赛创科技有限公司)，其他试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的预制备 称取适量的壳聚糖溶解于0.1% mol/L的醋酸溶液1 mL中，在磁力搅拌作用下充分溶解；在冰浴条件下，将适量60%的β-GP溶液缓缓滴入壳聚糖醋酸溶液中，充分搅拌10 min后制备得空白温敏凝胶。将Lnxc粉碎后过80目筛，称取适量，将其混悬于空白温敏凝胶中即得载Lnxc壳聚糖温敏凝胶。胶凝温度(36.5±0.5)℃，胶凝时间(4±0.5)min，通针性良好。

2.2 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶制备工艺的优化

2.2.1 壳聚糖浓度 配制1%、2%、3%、4%的壳聚糖醋酸溶液各1 mL，冰浴搅拌条件下缓慢滴入相同量60%的β-GP溶液，调节pH到7.0。以胶凝温度、胶凝时间及通针性作为评价指标，在水浴加热条件下观察不同浓度的壳聚糖对载Lnxc壳聚糖温敏凝胶形成的影响，采用倒置法观察凝胶的形成。胶凝温度随着壳聚糖浓度的增大而降低，1%壳聚糖通针性较好，但直至50 ℃未形成凝胶；2%壳聚糖通针性良好，胶凝温度46 ℃且胶凝时间较长(556 s)，不利于药物在关节腔形成凝胶；3%壳聚糖通针性良好，胶凝温度为37.8 ℃且胶凝时间为261 s；4%壳聚糖胶凝温度31 ℃，胶凝时间268 s，但通针性较差，不宜注射。因此，以3%的壳聚糖为最佳。

2.2.2 β-GP浓度 配制3%壳聚糖醋酸溶液2份各1 mL，分别滴加30%和60%的β-GP，调节pH到7.0。以胶凝温度、胶凝时间及通针性作为评价指标，水浴加热条件下观察不同浓度的β-GP对载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的形成的影响。30%β-GP形成凝胶的胶凝温度为37.5℃、胶凝时间为311 s，60%β-GP形成凝胶的胶凝温度为37.3℃、胶凝时间为287 s。但是30%β-GP形成凝胶后体系外含有少量的流动状液体，60%β-GP则形成了均一、稳定的凝胶，故以60%β-GP为最佳。

2.2.3 pH值 配制3%壳聚糖溶液4份各1 mL，分别滴加60%的β-GP调节pH值到6.6、6.8、7.0、7.2。水浴加热条件下，载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的胶凝温度分别为38.7、38.2、37.7、36.9 ℃，胶凝时间分别为283、276、259、236 s，通针性均较好。因此，应滴加60% β-GP调节pH值到7.2左右。

2.2.4 载药量 配制3%壳聚糖溶液5份各1 mL，分别滴加60%的β-GP调节pH值到7.2，然后向其中分别加入1、1.5、2、2.5、3 mg的Lnxc。在水浴加热条件下，载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的胶凝温度分别为37.0、36.9、36.6、37.0、36.7 ℃，胶凝时间分别为241、239、223、267、228 s，通针性均较好。为后期释放实验中能达到紫外分光光度计的检测限，故将载药量定为2 mg。

2.3 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶流变学观察 采用椎板法。取按最佳处方新鲜制备的载Lnxc壳聚糖温敏凝胶，将其置于平板和椎板之间的空隙中；然后，逐渐减小平板与椎体之间的距离使两者闭合，设置稳态剪切速率(γ)为0～1 000/s。在固定γ为10/s的条件下，记录黏度(η，Pas)随温度升高的变化[7]；在37 ℃恒温条件下，记录剪切应力(τ，Pa)和黏度(η，Pas)随γ升高的变化。由图1(a)可知，在γ不变的条件下，温敏凝胶的η在10～27 ℃随温度升高而降低，27～40 ℃随温度升高而增大，温度为32 ℃时的η大于10 ℃时的η。该现象与温敏凝胶的物理状态相符，即当温敏凝胶处于低温条件下时为溶液状态。27 ℃后随温度升高溶液η逐渐增大，32 ℃即可形成凝胶，但胶凝时间较长，36 ℃下胶凝时间较为适宜。由图1(b)可知，当温敏凝胶处于37 ℃的环境下，τ随γ增大而增大，η随γ增大而减小，其流变学行为表现为假塑性流体的特征。依据Ostwald-Dewaele方程的对数形式[8]：ln η= ln k+ (n-1) ln γ。其中n值为非牛顿指数，n越小说明非牛顿流体的性质越显著；k为稠度系数，表示与牛顿流体偏离的程度。将γ对数值和η对数值进行线性拟合，得方程ln η=6.0475-0.1872 ln γ 。其中n为0.81，n值小于1,说明载Lnxc温敏凝胶属于非牛顿流体，线性相关系数r为0.997(表明方程拟合度相对较好)。

注：a图为温敏凝胶的η随温度变化的趋势；b图为温敏凝胶的τ、η随γ变化的趋势。

图1 载Lnxc温敏凝胶流变学性质分析

2.4 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的稳定性观察

2.4.1 离心试验 将新鲜制备的温敏凝胶置于10 mL的离心管中，以3 000 r/min离心20 min，凝胶无分层现象。

2.4.2 温度试验 将新鲜制备的温敏凝胶分装于西林瓶中，密封后分别置于-20 ℃、4 ℃、25 ℃的条件下。第10天-20 ℃条件下的凝胶出现结冰现象，4 ℃和25 ℃条件下的凝胶无任何变化，因此该凝胶应贮存于4～25 ℃的环境中。

2.5 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的体外释放试验 采用动态膜透析法。制备载Lnxc温敏凝胶和浓度为1 mg/mL Lnxc溶液，分别吸取1 mL和2 mL置于截留分子量为8 000～14 000 Da的透析袋中。将透析袋两端用细绳扎紧，置于37 ℃恒温水浴中平衡5 min，使载药温敏凝胶胶凝。将载药凝胶和药物溶液分别置于含28 mL PBS释放介质释放介质(含1%吐温-80，pH 7.4)的离心管中，将离心管置于转速为100 r/min、水浴温度为37 ℃的摇床中震荡，按以上操作平行3次试验。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取5 mL释放介质，同时补充5 mL 37 ℃的新鲜释放介质，采用紫外分光光度法测定Lnxc释放量。

由图2可知，Lnxc溶液在释放介质中释放较为迅速，8 h的累积释放率达到86.7%；而Lnxc凝胶释放较为缓慢，8 h的累积释放率为43.36%，72 h的累积释放率达到86.41%，缓释效果显著。Lnxc溶液和载药温敏凝胶的体外释药均符合Higuchi方程，回归系数r分别为0.992和0.990,说明药物均匀的分布在载体中。采用Peppas方程[9]分析Lnxc溶液和载药温敏凝胶的释药机制,得方程Log Q=0.389 1 Log t+1.611和Log Q=0.324 2 Log t+1.342，释药系数n分别为0.381 9和0.324 2。对于圆柱形制剂，当n≤0.45时药物的释放机制为Fickian扩散，回归系数r分别为0.997和0.993。

注：sol为Lnxc溶液；gel为载Lnxc温敏凝胶

图2 Lnxc溶液和载Lnxc温敏凝胶的体外释放曲线

3 讨论

骨关节炎是一种最常见的关节疾病，主要是由关节软骨变性，关节软骨的蛋白多糖生物合成异常导致的退行性病变[1]，严重影响患者的生活质量。Lnxc是一种非甾体抗炎药，通过抑制环氧合酶和诱导性一氧化氮合酶，防止炎症介质的生成，广泛应用于术后疼痛和类风湿关节炎[2]。温敏凝胶是指以溶液状态给药后，通过高分子材料对外界温度的响应而发生相转变，由液态转化为非化学交联的半固体凝胶制剂[3]，用于病变部位的局部给药可延长释药周期、降低给药剂量和药物不良反应，且工艺相对简单[4]。壳聚糖是一种天然的阳离子生物多糖，其本身无温敏性，但在其骨架上嫁接如异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、β-GP后即具有显著温敏特性[5]。壳聚糖/β-GP温敏凝胶具有生理中性、37 ℃即可凝胶化、延缓药物释放等特点，可以作为药物的载体材料[6]。

因壳聚糖难溶于大部分的有机溶剂、水和碱，因此本文将壳聚糖溶解于0.1%的醋酸溶液中。在稀酸条件下，壳聚糖上的氨基被质子化，破坏了其分子内部的氢键和立体规整性，羟基与水分子发生水合作用，导致壳聚糖分子溶胀而溶解[10]。β-GP是一种弱碱，加入到含有醋酸的壳聚糖溶液中，首先中和游离的氢离子，使溶液的pH升高(pH≥6.2)；壳聚糖链上的电荷密度减少,降低了壳聚糖链间的静电排斥力,使疏水键和氢键引力相对提高，从而出现沉淀；继续加入β-GP ,弱碱作用使β-GP上的磷酸盐和壳聚糖上的胺基相互吸引而使甘油部分暴露 ,壳聚糖链分离，因此壳聚糖在较高的 pH 值下仍然可以保持液态[11]。温度升高后,由于分子热运动加强，静电斥力下降，壳聚糖与水之间的氢键作用降低，使得温敏凝胶的η降低；当疏水键和壳聚糖链间氢键的引力大于链间的静电排斥力时,壳聚糖分子相互聚集，η增加，发生物理结合形成凝胶。本研究结果显示，载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的最佳处方为Lnxc 2 mg、3% 壳聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制备的温敏凝胶属于非牛顿流体，离心后无分层现象，4 ℃和25 ℃条件下呈流动状，37 ℃发生相变形成凝胶。Lnxc溶液8 h药物累积释放率86.70%，载Lnxc温敏凝胶72 h药物累积释放率86.41% ，释药规律符合Higuchi方程。

综上所述，所制备的载Lnxc壳聚糖温敏凝胶性质稳定，体外释放结果显示具有良好的缓释作用。尽管体外释放条件已模拟体内条件，但是与体内真实情况依然具有一定的差异性，因此还需体内药物动力学的评价进一步研究其缓释效果。

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山东省科技发展计划项目 (2014GSF121012)。

窦明金(E-mail: mingjindou1965@126.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.036

R944.9

A

1002-266X(2017)10-0100-03

2016-11-12)