教学实验用阿米巴原虫培养方法的筛选与评价

杨细凤,李仲娟,余福恒,李 茉

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄石市东方社区服务中心，湖北 黄石 435000)

教学实验用阿米巴原虫培养方法的筛选与评价

杨细凤1,李仲娟1,余福恒2*,李 茉1

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄石市东方社区服务中心，湖北 黄石 435000)

为满足医学寄生虫课原虫教学实验所需，筛选来源于自然界的阿米巴原虫进行培养，以便找到更有效、便捷、经济且能满足临床教学所需阿米巴原虫的培养方法。采用1640细胞培养液、洛氏培养液、青菜水培养液培养来源于自然界的阿米巴原虫，观察其生长状态，分别比对阿米巴原虫到达包囊期和滋养体期所需的培养时间及不同时间复苏时的成活率。结果为： 青菜水培养液方法对自然界的阿米巴原虫培养效果最佳,青菜水和1640培养液到达包囊阶段时间分别为(16±0.35) h、(18±0.50) h，与洛氏培养液到达包囊时间(22±1.2) h相比均有显著性差别(P<0.05)；青菜水和1640培养液到达滋养体的时间分别为(22±2.24) h、(26±3.45) h，与洛氏培养液到达滋养体时间(30±2.5) h相比均有显著性差别(P<0.01)；青菜水培养液和1640培养液6个月后再次复苏成活率分别为88%、78%，与洛氏培养液的62%相比均有显著性差别(P<0.01)。青菜水培养液法可作为自然界的阿米巴原虫培养的首选方法，培养原虫时间较短、复苏成活率高，且经济安全，培养的原虫可作为人体寄生虫学实践教学用样本的替代品。

教学实验；原虫；培养液；阿米巴原虫

阿米巴病分肠道阿米巴病和肠外阿米巴病，寄生于结肠引起阿米巴痢疾的致病性原虫是寄生虫学教材中的重点章节。临床上肠道阿米巴病的诊断仍以粪便中发现阿米巴原虫为可靠依据。目前也有学者使用分子生物学方法鉴定阿米巴原虫[1]，但由于成本和操作等原因，临床上肠道阿米巴病的诊断仍以粪便中发现阿米巴原虫为可靠依据[2]。由于存在下面几种因素：①病人发病时分散；②患者多在发病的初期就进行了早期检查，粪便样本中原虫数量通常不多；③原虫在常温下难以成活；④粪便样本的采集和保存均不规范等，故而实验检查阳性率比较低，易造成临床误诊或漏诊。因此，强化医学生的实践课教学非常必要。然而在实践教学实施过程中，也正是因为阿米巴病原虫标本来源较少，且接触致病性原虫还存在被感染的危险，给临床实践教学的开展带来了极大困难。据国外文献报道可以从自然界土壤或水中分离福氏耐格里阿米巴原虫、双核匀变原虫或狒狒巴拉姆希阿米巴原虫[3-4]等自由生活致病性阿米巴原虫。考虑到致病性阿米巴会带来安全隐患，本研究旨在从稻草中分离、培养非致病性阿米巴原虫，用于开展医学寄生虫课阿米巴原虫实践教学。

1 材料与方法

1.1 材料

当季稻草和新鲜菜叶，采集于大冶市陈贵镇；洛氏培养液用通心菜和生菜购于超市，由湖北理工学院基础实验室制备;改良型RPMI-1640细胞培养液购自武汉大学试剂中心；日本OLYMPUS CKX41倒置生物显微镜；上海新苗医疗器械电热恒温培养箱DNP-9272BS-III；苏州净化二级生物安全柜BHC-1300IIB2；6孔培养板和细胞培养用的吸头购自美国Costar公司；二甲基亚砜购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 虫种来源

将稻草剪成2～3 cm小段，使用3种培养液在培养箱中37 ℃培养，分别经16～48 h即可分离获取自然界生活的阿米巴滋养体及原虫。本实验分离获取的自然界阿米巴包囊样本保存在实验室，已连续反复使用了3年(2013.9 —2016.9)。

1.2.2 培养液制备

洛氏培养液采用通心菜水和生菜水制备[4]。 考虑到阿米巴虫种来源的实际环境，我们实验室青菜水培养液的制备是将小白菜叶与田野采集的野菜(面条菜、马兰头、苦菜等)分别洗净，加入适量自来水于烧杯中煮沸5～8 min , 冷却后过滤。再将小白菜叶水与野菜水按6∶4的比例装入无菌玻璃瓶中，4 ℃冰箱保存使用。

1.2.3 虫种的保存和复苏

将实验教学所用的培养自然界生活阿米巴原虫的培养皿用PBS液洗涤2次，倒掉上清液，试管加盖，4 ℃冰箱保存。再次复苏时直接加入相应培养液，37 ℃培养48 h换液传代即可。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 3种培养液对原虫生长的影响

1)稻草来源的原虫初次培养约15～23 h可见到包囊期原虫。 1640细胞培养液使用加入2%的小牛血清，原虫在培养时使用6孔培养板在生物安全柜中进行操作；青菜水培养液和洛氏培养液同法制备后4 ℃无菌保存。当季稻草在 1640培养液中培养约18 h后可以发现包囊期原虫，低倍镜下原虫多为圆形透明，包核明显(图1a)；当季稻草在洛氏培养液中约22 h后可以发现包囊期原虫，原虫多为椭圆形，包核不明显(图1b)；当季稻草在青菜水培养液中培养约16 h后可以发现包囊期原虫，包囊期原虫多为椭圆形，较其他2种培养液中的原虫大，内有明显的空泡(图1c)。

2)分别加入3种培养液进行传代培养后,显微镜下可观察包囊开始涨大,出现亮黄色的生物折光,囊壁变薄、内呈空泡可见胞核。继续培养6～8 h后可见活动的含吞噬物的滋养体。1640培养液中原虫在200倍镜下多为圆形透明，内含少量吞噬物，运动缓慢(图2a)；洛氏培养液中原虫多为指状伪足，吞噬物较多，呈不定向运动(图2b)；青菜水培养液中原虫多为椭圆形，吞噬物呈块状，运动活泼(图2c)。

2.2 3种培养液中原虫不同生长阶段培养所需时间的比较

3种培养液中原虫不同生长阶段培养所需时间的比较结果见表1。

表1 3种培养液中原虫不同生长阶段培养所需的时间(±s, n=20)

注:1640培养液、青菜水培养液在包囊期培养所需时间分别与洛氏培养液比较，◆P均小于0.05；1640培养液、青菜水培养液在滋养体期培养所需时间分别与洛氏培养液比较，◆◆P均小于0.01。

2.3 3种培养液对原虫保存与复苏的影响

原虫的保存有2种方法，4 ℃冰箱保存和-20℃以下的冰冻保存，教学使用的医学原虫一般采用4 ℃冰箱保存。本次分别观察了3个月、6个月、12个月和24个月保存后原虫复苏的成活率。由于教学中原虫使用周期为3～6个月，因此重点对3个月和6个月的原虫复苏成活率进行比较分析。3个月1640培养液中原虫复苏成活率为(90±2.1)%，青菜水培养液为(92±0.31)%，洛氏培养液为(91±0.12)%。1640培养液、青菜水培养液分别与洛氏培养液的原虫复苏成活率比较无显著性差别，P>0.05。6个月1640培养液原虫复苏成活率为(78±1.26)%，青菜水培养液为(88±0.36)%，洛氏培养液为(62±2.21)%。1640培养液、青菜水培养液分别与洛氏培养液的原虫复苏成活率比较有显著性差别，P<0.01。原虫复苏成活率比较结果如图1所示。

3 讨论

湖北理工学院医学院寄生虫学教研室承担了临床医学、护理学和检验医学等专业的人体寄生虫学课程的实验教学任务，医学原虫部分占该课程1/4的学时，以往实践性教学环节一直是从医院中寻找病人样本用于教学。受样本数量及保存条件的影响，该章节的实践教学仅限于原虫的形态学观察，原虫包囊期和滋养体期很少见到，严重影响实践教学效果。在2013年初，本实验室通过自然界土壤分离到福氏耐格里阿米巴原虫用于教学[5]，由于该方法存在致病性风险，缺乏安全保障，且冰冻保存后复苏成活率低，不太适用于教学。于是从2013年9月开始，分别采用3种培养液对当季小段稻草进行分离培养试验，成功培养出了非致病性阿米巴原虫，其包囊期原虫在4 ℃冰箱可以保存3个月以上，经过后期大量的培养，非致病性阿米巴原虫的运动状况、原虫包囊期的染色鉴定和原虫滋养体期的吞噬现象都可以让学生进行实际操作，学生切身了解接近了自然，提高了学生的动手操作能力和学习兴趣，非常适合不同学期中人体寄生虫学课程实践教学的开展。

从3种培养液分离原虫结果来看，青菜水培养液可作为培养无致病性阿米巴原虫的首选。虽然洛氏培养液也被很多实验室使用，但其培养结果显示，包囊期原虫培养时间、滋养体期原虫的吞噬现象和原虫的保存复活率都与本实验室自制青菜水培养液有显著差别。1640培养方法分离的原虫在运动、吞噬现象及保存复活率等方面与青菜水培养方法比较均存在很大不足，同时培养成本较高。

正因如此，本实验室已连续3年使用青菜水培养方法保存包囊阶段的阿米巴原虫并扩大培养，这样不仅为该课程实践教学提供了理想的样本，同时还降低了实验室购买耗材的成本。今后我们将进一步创新青菜水培养方法扩大培养，指导学生用阿米巴原虫活体微培养技术[6]进行实际操作，让学生能更好地理解和掌握理论教学内容。

[1] 卢艳，陈家旭，张永年,等.FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织内阿米巴原虫的初步研究[J].中国人兽共患病学报,2016，32(2):128-132.

[2] 张小萍，何艳燕，王真瑜,等.上海市综合性医院腹泻患者中溶组织内阿米巴感染现状调查[J].中国血吸虫病防治杂志,2015，27(6):600-603.

[3] GS Visvesvara,H Moura，FL Schuster.Pathogenic and opportunistic free-living amoebae:Acanthamoeba spp.,Balamuthia mandrillaris,Naegleria fowleri,and Sappinia diploidea[J].Fems Immunology & Medical Microbiology,2011,50(1):707-713.

[4] Gianinazzi C,Schild M,Wüthrich F,et al.Potentially human pathogenic Acanthamoeba isolated from a heated indoor swimming pool in Switzerland[J].Experimental Parasitology,2009,121(2)：180-186.

[5] 彭恒，朱淮民.致病性自由生活阿米巴的培养[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009，27(4):361-363.

[6] 陈洪友,姜庆五,李勤学,等.阿米巴活体微培养法[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005，23(6):453-455.

(责任编辑 吴鸿霞)

Screening and Evaluation of Amoeba Cultivation for Teaching and Experiment

YangXifeng1,LiZhongjuan1,YuFuheng2*,LiMo1

(1School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003;2Huangshi Dong Fang Community Service Center,Huangshi Hubei 435000)

Objective： To establish a sound,easy and economic culturing system for the cultivation of amoeba protozoa from natural sources in order to meet the need for protozoa experimental teaching of hospitals.Methods:Amoeba protozoa were cultured with 1640 cell culture media,Rockwell culture medium and vegetables water culture medium respectively.Growth status,development times of cysts and trophozoites and the survival rate at different recovering time were compared among the 3 groups.Results:The cysts stage time for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1640 cell culture medium were (16±0.35) h and (18±0.50) h which had significant difference(P<0.05)from that with Rockwell culture medium,(22±1.2) h.The nourish body stage time for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1640 cell culture medium were (22±2.24) h and (26±3.45) h,which also had extremely significant difference(P<0.01) from that with Rockwell culture medium(30±2.5) h.Recovering survival rate for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1 640 cell culture medium after 6 months were as high as 88% and 78%, which had extremely significant difference(P<0.01) from that with Rockwell culture medium,62%.Conclusion:The culture time of amoeba protozoa from natural sources with vegetables water culture medium is short and its recovering survival rate is high.So,vegetables water culture medium can be used as a preferred medium for the culture of amoeba protozoa from natural sources and can be a substitute for the test sample of Human Parasitology teaching practice.

experimental teaching；protozoa；culture medium；amoeba protozoa

2017-02-10

杨细凤,实验师,本科。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.02.013

R382.1

A

2095-4565(2017)02-0059-04

*通讯作者:余福恒,主管技师，本科。