益气化瘀解毒法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠DNA甲基化酶3b基因的影响※

贺梅娟 杨若濒 杨晋翔 安 静

(北京市丰台区卢沟桥社区卫生服务中心中医科，北京 100165)

实 验 研 究

益气化瘀解毒法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠DNA甲基化酶3b基因的影响※

贺梅娟 杨若濒 杨晋翔1安 静1

(北京市丰台区卢沟桥社区卫生服务中心中医科，北京 100165)

目的 观察益气化瘀解毒法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生模型大鼠DNA甲基化酶3b(DNMT3b)基因的影响。方法 将60只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为造模组50只、空白组10只。造模成功后将造模组剩余的33只大鼠随机分为模型组、维酶素组、消痞颗粒组，每组11只。模型组予0.9%氯化钠注射液，维酶素组予维酶素悬浊液，消痞颗粒组予消痞颗粒中药制备药液，各组均每日灌胃1次，连续治疗12周后检测各组大鼠DNMT3b蛋白表达量。结果 维酶素组、模型组DNMT3b蛋白表达量较空白组均明显升高(P<0.01)；消痞颗粒组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。维酶素组、消痞颗粒组DNMT3b蛋白表达量较模型组降低(P<0.01)；消痞颗粒组低于维酶素组(P<0.01)。结论 中医益气化瘀解毒法可以逆转胃黏膜异型增生，其作用机制可能是通过下调DNMT3b而实现的。

益气祛瘀；解毒；胃炎,萎缩性；增生；大鼠,Wistar；基因；动物实验

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中均居第3位[1]。异型增生、肠化生以及导致二者出现的慢性萎缩性胃炎是胃癌较为常见的早期病变。现阶段世界范围内对胃癌尚无有效治疗手段，因此加强对胃癌的防御有重大意义，该方面的研究逐渐引起了许多专家与学者的关注。最新研究表明，胃癌成因较复杂，并不是由单一因素所引起，有研究表明，抑癌基因启动子区域CpG岛的高甲基化状态可导致基因表达沉默，从而导致肿瘤的发生[2-3]，而抑癌基因CpG岛高甲基化与DNA甲基化酶(DNMT)的高表达密切相关，DNMT3b是DNMT之一，其失活或突变与肿瘤发生发展关系密切[4]。本研究通过建立慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠模型,观察益气化瘀解毒法对DNMT3b的影响,为临床防治胃癌前病变,降低胃癌的发病率提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 共选取SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，4周龄，体质量约100 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 药物 消痞颗粒(药物组成：党参、炙百合、乌药、香橼、丹参、三七粉、莪术、蒲公英、白花蛇舌草),由北京中医药大学第三附属医院制剂室制成含生药9 g/g的冲剂,使用时配制成浓度为0.36 g/mL的药液;维酶素片(河北环海药业有限公司，国药准字H13023904,批号20090506)，碾成粉末状，配制成浓度为0.15 g/mL的悬浊液,滤去糖衣沉渣备用;N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG，日本东京化成工业株式会社，产品编号M0527)，用去离子水配制成1 g/L的母液,存放于4 ℃冰箱备用，使用时用SPF级动物饮用水稀释为120 μg/mL的溶液,整个过程均需避光操作保存;雷尼替丁饲料,盐酸雷尼替丁胶囊(石药集团欧意药业有限公司,国药准字H13022873，批号：100902256)，由北京科澳协力饲料有限公司制成含0.03%雷尼替丁的颗粒状SPF级大鼠饲料;氨水由西陇化工有限公司生产，生产批号：1503232，每日用SPF级动物饮用水配制成0.05%的溶液。

1.1.3 仪器 Allgre 21R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；MK3酶标仪(Thermo公司)；VE180小型高通量电泳槽(上海天能公司)；VE186转移电泳槽(上海天能公司)；PowerPac HC高电流电源(美国伯乐公司)；酸碱度测试仪(德国Sartorius公司)；振荡机(其林贝尔公司)；匀浆机(瑞士Fluka公司)。

1.1.4 试剂 BCA蛋白定量试剂盒(北京康为公司)；Protein ladder(北京博迈德生物)；PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；一抗DNMT3b为兔单克隆抗体(Abcam公司，货号:ab16049)；二抗为辣根酶标记羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Jackson公司，货号:111-035-003)。

1.2 分组及造模 将60只大鼠随机分为2组，空白组10只，造模组50只。空白组大鼠给予普通饲料进行喂养。造模组大鼠予分笼喂养，每日饮用浓度为0.05%的氨水，氨水溶液须每日更新1次；采用0.03%的雷尼替丁饲料进行喂养，同时每日予120 μg/mL的MNNG灌胃，每只5 mL/kg，一直持续到第32周。在实验过程中于第20、24、26、28、30、32周末从造模组当中的大鼠中随机抽取2只大鼠，在完成造模之后，将存活的33只(造模期间死亡5只)大鼠随机分为3组：模型组、维酶素组、消痞颗粒组，每组11只，均以普通饲料进行喂养。模型组大鼠在普通喂养基础上予0.9%氯化钠注射液3 mL/kg灌胃，维酶素组大鼠在普通喂养基础上予维酶素悬浊液2 mL/kg灌胃，消痞颗粒组大鼠在普通喂养基础上予消痞颗粒药液3 mL/kg灌胃，灌胃每日1次，持续12周。在第44周末，本实验所有大鼠以戊巴比妥钠进行腹腔麻醉注射，进行全胃摘除，在摘除完成之后，需快速将胃沿大弯处切开，并用低温0.9%氯化钠注射液对胃的内容物进行清洗，将胃窦部黏膜封存，存储在液氮当中，并保持其温度≤-80 ℃。大鼠摘胃后均处死。

1.3 观察指标及方法 将胃黏膜组织从液氮中取出，放入预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨，然后装入预冷的EP管中，预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂)。组织按照10%匀浆，即10 mg组织加入100 μL RIPA裂解液，充分裂解。冰上孵育20 min后，13 000 r/min，4 ℃，离心20 min。取上清，分装-80 ℃保存。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。根据样品数量，试剂A∶B=50∶1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24 h内稳定；完全溶解蛋白标准品，取10 μL稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL；将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20 μL；将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min；测定A570 nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。分别取60 μg总蛋白与上样液混合，上样前煮沸5 min，将蛋白加入点样孔，电泳初始电压90 V，溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至120 V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。湿转法，转膜条件：300 mA恒流，0.45 μm孔径PVDF膜，转膜时间150 min，转移结束后，PVDF膜取出标记膜的方向。将膜完全浸没于5%牛血清三羟甲基氨基甲烷缓冲液(BSA-TBST)中，水平摇床孵育1 h。5%BSA-TBST稀释一抗，1∶1 000，4 ℃水平摇床孵育过夜。次日，TBST洗3次，每次10 min。5%BSA-TBST稀释二抗，1∶10 000，室温孵育45 min。TBST洗膜3次，每次10 min。加入显影液，暗室显色，扫描胶片，用Genpro32软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析，经内参β-actin校正后进行统计学分析。

2 结 果

各组DNMT3b蛋白表达量比较见表1、图1。

组 别nDNMT3b蛋白表达量空白组100.169±0.013模型组110.246±0.014*维酶素组110.240±0.019*△消痞颗粒组110.164±0.010△#

与空白组比较，*P<0.01;与模型组比较，△P<0.01；与维酶素组比较，#P<0.01

1为空白组；2为模型组；3为维酶素组；4为消痞颗粒组

由表1、图1可见，维酶素组、模型组DNMT3b蛋白表达量较空白组均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；消痞颗粒组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。维酶素组、消痞颗粒组DNMT3b蛋白表达量较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.01)；消痞颗粒组低于维酶素组，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因异常的累积过程，其中抑癌基因CpG岛高甲基化是重要致病因素之一,在其发生发展过程中起重要作用[5-6]。DNA甲基化是由DNMT催化完成的，DNMT是参与DNA甲基化修饰的重要功能蛋白，其作用是在S-腺苷酰-L-甲硫氨酸提供甲基的条件下，催化DNA分子胞嘧啶5号碳原子结合上甲基团，形成5-甲基胞嘧啶,生成甲基化DNA[7]。一般认为哺乳动物的DNMT有4种，DNMT1在DNA复制和修复中维持其甲基化，DNMT3则催化CpG从头甲基化，DNMT3包括2个从头甲基转移酶DNMT3a、DNMT3b和1个调节蛋白DNMT3L；另有一种为DNMT2，主要为tRNA的甲基转移酶，具有微弱的DNA甲基转移酶活性[7]。大量研究表明，DNMT3b高表达与乳腺癌、肝癌、白血病等多种恶性肿瘤发生发展关系密切[8-10]。在最近几年关于胃癌的成因研究当中，抑癌基因的甲基化研究一直较为火热，最新的研究进展表明，在不同的基因启动区中，DNMT3b异常表达与甲基化之间都存在着较大的联系[11-12]。

慢性萎缩性胃炎属中医学痞满、痞证范畴，本虚标实贯穿于本病的始终，本虚为脾胃气虚和(或)阴虚，标实为瘀血邪毒。邪毒有广义和狭义的概念，广义邪毒是指痰湿、湿热、热毒、食积、气滞等，狭义邪毒仅指热毒。以益气化瘀解毒法组方而成的消痞颗粒，方中党参补中益气，生津和胃，为君药；百合养阴润肺，止咳祛痰，清心安神，为臣药；乌药宣畅气机，温散寒邪，行气止痛；香橼理气宽中，和胃化湿；丹参活血，血脉流畅，通则不痛，为治胃病的良药；三七化瘀止血，活血定痛；莪术行气破血，消积止痛；蒲公英清热解毒，消痈散结；白花蛇舌草清热利湿，解毒抗癌。现代药理研究表明，党参具有增强机体免疫功能，提高巨噬细胞吞噬功能的作用[13]；丹参可促进胃黏膜的修复再生，从而使异型增生减轻或消失[14]；三七具有改善微循环、消炎及预防肿瘤等作用[15-16]；莪术可诱发或促进机体对肿瘤的免疫排斥反应[17]；白花蛇舌草能够调节免疫，增强肾上腺皮质功能，从而起到抑制炎症反应和免疫反应的作用，因此具有明显的抗菌消炎、抗肿瘤作用[18]。

本实验结果表明，模型组大鼠DNMT3b蛋白相对于空白组明显升高，充分说明DNMT3b的高表达明显存在于异型增生胃黏膜组织当中。本研究结果还显示以益气化瘀解毒法组方的消痞颗粒可下调DNMT3b的表达，这种作用与模型组和维酶素组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明消痞颗粒可有效下调DNMT3b蛋白的表达。综上所述，以益气化瘀解毒法组方的消痞颗粒逆转慢性萎缩性胃炎伴胃黏膜异型增生可能的作用机制为下调DNMT3b的表达。

[1] 陈万青,张思维,曾红梅,等.中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J].中国肿瘤,2014,23(1):1-10.

[2] 罗欣,谢文练,韩金利,等.DNA甲基转移酶1、3b基因在膀胱癌的表达及意义[J].中华实验外科杂志,2008,25(9):1220.

[3] Esteller M. Relevance of DNA methylation in the management of cancer[J].Lancet Oncol,2003,4(6):351-358.

[4] Yu Y,Khan J,Khanna C,et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators[J].Nat Med,2004,10(2):175-181.

[5] Choi IS,Tsung-Teh WU.Epigenetic alterations in gastric carcinogenesis[J].Cell Res, 2005,15(4):247-254.

[6] Tamura G.Promoter methylation status of tumor suppressor and tumor-related genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia[J].Histol Histopathol,2004,19(1):221-228.

[7] Cheng X,Blumenthal RM.Mammalian DNA Methyltransferases: A Structural Perspective[J].Structure，2008，16(3):341-350.

[8] 王勇,王晓东,陈文捷，等.散发性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表达与ERα基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系[J].天津医药,2015,43(5):500-504.

[9] 李英华，刘学东，郭秀芬，等.DNA甲基转移酶在慢性髓系白血病患者的表达及临床意义[J].中国实验血液学杂志,2015,23(6):1547-1550.

[10] 冯悦静，魏小玲，尤爱国，等.肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表达[J].郑州大学学报：医学版,2014,49(3):323-326.

[11] Ding WJ,Fang JY,Chen XY,et al.The expression and clinical significance of DNA methyltransferase proteins in human gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2008,53(8):2083-2089.

[12] 叶振,刘文天.DNA甲基转移酶在胃癌和癌前病变中的表达及意义[J].泰山医学院学报,2010，31(5):351-354.

[13] 焦红军.党参的药理作用及其临床应用[J].临床医学,2005,25(4):92.

[14] 吴时胜.丹参对萎缩性胃炎伴异型增生的逆转治疗研究[J].时珍国医国药,2002,13(12):751-752.

[15] 张会存,史瑞,李健,等.黄芪、三七对萎缩性胃炎大鼠胃黏膜HSP70及其转录因子GAF表达的影响[J].世界华人消化杂志,2013,21(7):559-566.

[16] 马玲玲,周正华.周正华运用蒲公英治疗消化系统疾病临证经验[J].吉林中医药,2011,31(6):510-511.

[17] 钟锋,顾健,张亮亮,等.莪术药理作用的现代研究进展[J].中国民族民间医药杂志,2010,19(13):67-68.

[18] 赵林林.白花蛇舌草化学成分与药理作用研究进展[J].河南中医,2012,32(10):1372-1374.

(本文编辑：李珊珊)

Effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNMT3b gene in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia

HEMeijuan*,YANGRuobin,YANGJinxiang,etal.

*DepartmentofTraditionalChineseMedicine,LugouqiaoCommunityHealthServiceCenterofFengtaiDistrictinBeijingCity,Beijing100165

Objective To observe the clinical effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNA methylationase 3b (DNMT3b) in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia. Methods 60 SPF healthy male Wistar rats were randomly divided into modeling group (n=50) and blank group (n=10). After successful modeling, the remaining rats (n=33) in modeling group were randomly divided into model group, vitacoenzyme group, Xiaopi granule group, 11 rats in each group. The model group was treated by 0.9% sodium chloride injection, the vitacoenzyme group was treated by vitacoenzyme suspensions and the Xiaopi granule group was treated by Xiaotuqi granule liquid. The rats in each group were intragastric administration one time per day for 12 weeks, and then the protein expression of DNMT3b was measured. Results The protein expressions of DNMT3b in vitacoenzyme and model group were significantly higher than that in blank group (P<0.01), and there was no significant difference between the Xiaopi granule group and the blank group (P>0.05). The protein expression of DNMT3b in vitacoenzyme group and Xiaopi granule group was obvious decreased as compared with that in model group (P<0.01), which in Xiaopi granule group was lower than that in vitacoenzyme group (P<0.01). Conclusion Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy can reverse the dysplasia of gastric mucosa, its mechanism may be achieved by down-regulation of DNMT3b.

Qi-tonifying and blood stasis-removing; Detoxification；Gastritis; Atrophic; Dysplasia; Rat; Wistar; Gene; Animal experiment

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.024

※ 项目来源：国家自然科学基金项目(编号：81173232)

贺梅娟(1980—)，女，主治医师，博士。研究方向：脾胃病中医药防治。

R573.32；R9-33

A

1002-2619(2017)03-0411-04

2016-07-25)

1 北京中医药大学第三临床医学院消化科，北京 100029