肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的研究※

毕建璐 魏 敏 孙晓敏 聂晓莉 肖 雅 莫 伟 赵晓山 罗 仁

(广东省第二中医院内分泌肾病科，广东 广州 510095)

肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的研究※

毕建璐 魏 敏1孙晓敏2聂晓莉2肖 雅3莫 伟 赵晓山2罗 仁△

(广东省第二中医院内分泌肾病科，广东 广州 510095)

目的 观察肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的变化，为肾阳虚证的客观化研究提供依据。方法 分别选取典型的肾阳虚证5例、正常健康人6例纳入研究，以抗体芯片分析2组人群血浆蛋白质表达谱的差异。结果 肾阳虚证组与正常对照组之间存在差异表达上调的蛋白共14条，其中与生长发育生殖能力相关的为Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)、卷曲蛋白1和4(FZD-1，FZD-4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、激活素A受体ⅡA型(ActRⅡA)、骨形态发生蛋白-5(BMP-5)、潜在转化生长因子β结合蛋白1(LTBP-1)、成纤维细胞生长因子样受体1(FGFRL1)，与免疫系统相关的为CXC趋化因子受体3(CXCR3)、白细胞介素27受体α(IL-27Rα)、脂多糖结合蛋白(LBP)、白细胞介素13受体Ⅱα(IL-13Rα2)、集落刺激因子-1(CSF-1)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、ActRⅡA。结论 肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的变化涉及生长发育生殖能力、免疫应答、细胞凋亡等，与中医肾阳虚证所表现的腰膝痠软、耳鸣耳聋、发脱齿松、性欲减退等症状相符。

肾阳虚；蛋白表达谱；胚胎发育；免疫

现代研究证明，只有极少数的疾病是因为单一基因出现改变而发生的，大部分疾病都是因多个基因失调导致的。本课题前期研究发现[1-2]肾阳虚证患者出现多个明显的基因差异性表达，这些差异涉及多个信号转导通路，如钙细胞传导通路、转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路、细胞因子间受体相互作用通路等，现代临床研究结果也证明了这一结果[3-6]。而基因又要在表达相应蛋白质的情况下才能影响机体的生物学功能。本研究拟在前期研究基础之上，采用“病证结合”的方法，以肾阳虚证人群为研究对象，以抗体芯片分析其血浆蛋白质表达谱的变化，为肾阳虚证的客观化指标提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 诊断标准 肾阳虚证的辨证依据《中医虚证辨证参考标准》[7]。主症：腰膝痠软，性欲减退，畏寒肢冷。次症：精神萎靡，夜尿频多，下肢水肿，动则气促，发槁齿摇，舌质淡苔白，脉沉迟，尺无力。诊断：主症具备2项(腰膝痠软必备)，次症至少具备2项即可辨证成立。

1.1.2 纳入标准 ①年龄在18～60岁之间；②符合肾阳虚证的诊断标准，或正常健康人；③自愿签署知情同意书。

1.1.3 排除标准 ①不符合纳入标准者；②妊娠或哺乳期妇女；③患有心脑血管、肝、肾、造血系统、免疫系统等器质性病变者；④精神疾病者。

1.2 一般资料 在南方医科大学附属南方医院招募5例典型的肾阳虚证作为肾阳虚证组(基本情况见表1)，6例健康人作为正常对照组。肾阳虚证组5例，男2例，女3例；年龄31～57岁，平均(44.00±11.77)岁。正常对照组6例，男3例，女3例；年龄30～48岁，平均(35.67±6.53)岁。

表1 肾阳虚证组基本情况

1.3 试验方法

1.3.1 主要试剂与仪器 试剂：人类生物素标记法抗体芯片(RayBio Human Cytokine Antibody Array membranes)，美国RayBiotech公司，货号：AAH-BLG-1-4，内含标记试剂、内参、封闭液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、荧光染料等。主要仪器：电子天平(北京市测维光电仪器厂)，低温高速离心机(美国Sigma-Aldrich公司)，超净工作台，微量移液器(德国Eppendoff公司)，荧光扫描仪[美国Maxwell Sensors Inc.(MSI.)公司，便携式FS-Scanner]。

1.3.2 试验方法 清晨空腹采血，离心机分离血清，取血浆后，应用1×磷酸盐缓冲液(PBS)(即10 mmol PBS)(pH=8)将血浆稀释5倍(按20 μL血浆∶80 μL PBS比例稀释)，取200 μL稀释后的血浆装入透析管，并用1×PBS(pH=8)500 mL 4 ℃透析，更换1×PBS再次透析。每次至少3 h，轻微震荡。应用生物素标记样本：加40 μL内参至装有35 μL透析过的血浆样本中。将标记试剂加至血浆样本管中，立即混匀，室温孵育30 min，轻轻震荡，加3 μL终止液至上血浆样本管中，迅速进行透析。样本透析后10 000 g离心力4 ℃离心5 min，-20 ℃保存备用。芯片封闭及孵育：芯片的每个子阵中加入400 μL封闭液，室温孵育30 min，避免产生气泡。去除每个子阵中的封闭液，加400 μL上述标记样品，室温孵育2 h或4 ℃过夜，轻轻震荡。去除溶液，去掉芯片匣子装置，取出玻璃片基。将芯片放入30 mL离心管中，加30 mL 1×洗涤液Ⅰ，震荡10 min，去除洗涤液，再重复2次。30 mL 1×洗涤液Ⅱ洗涤芯片，2次，每次5 min。最后用30 mL蒸馏水洗涤5 min。然后将芯片放入30 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min，使片基干燥或避光放置自然干燥，确保检测前片基干燥。荧光扫描仪，Cy3通道检测。

1.4 统计学方法 采用SAM软件分析，总体比较正常对照组、肾阳虚证组的蛋白质表达谱。差异表达靶蛋白的筛选条件：︱Score(d)︱控制在2倍以上(d代表差值，即difference)，同时差异倍数即Foldchange为2倍以上，则代表该蛋白属于差异表达。

2 结 果

芯片扫描分析结果 通过对2组芯片中靶蛋白的比值发现，2组间存在表达上调的差异蛋白共14条。经检索互联网生物学公共数据库，获得每条差异蛋白的名称和其他基本信息，见表2。

表2 2组差异表达蛋白的名称及基本信息

注：“↑”表示表达上调

3 讨 论

人类生物素标记法抗体芯片有灵敏度高、特异性高和准确性高的特点，可以同时检测507种靶蛋白的表达水平，包括趋化因子、细胞因子、生长因子、蛋白酶、可溶性受体、可溶性黏附分子等。本研究对肾阳虚证蛋白质芯片的检测共发现14条表达上调的蛋白，主要涉及生长发育生殖能力、免疫应答及细胞凋亡等方面。其与中医肾阳虚证所表现的腰膝痠痛、耳鸣、性欲减退、发脱齿松等症状相符。

3.1 与生长发育生殖相关 中医学认为，肾藏先天之精，主生长发育、生殖，肾精化为肾气，对机体有温煦、激发、兴奋和制约阴寒等作用者称为肾阳。肾阳为一身阳气之根本，能促进精血津液的化生，并使之转化为能量，促进脏腑组织器官功能活动，是人体生命活动力的源泉。肾阳虚损，温煦失职，命门火衰，不能蒸化肾阴化生精气，则导致虚寒衰弱诸症，表现为性欲减退，男子阳萎早泄、女子不孕等。本研究结果显示，一些与生长发育生殖相关的靶蛋白，如Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)、卷曲蛋白1和4(FZD-1，FZD-4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、激活素A受体ⅡA型(ActRⅡA)、骨形态发生蛋白-5(BMP-5)、成纤维细胞生长因子样受体1(FGFRL1)、潜在转化生长因子β结合蛋白1(LTBP-1)等表达异常。

Csk是非受体酪氨酸激酶的一个亚群，是调节酪氨酸磷酸化及细胞生长、分化的必需酶[8]。Wnt信号系统参与了胚胎背腹轴的形成、细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育事件，在动物发育过程中起关键作用[9]。Wnt通过其受体，即卷曲蛋白(FZD)实现对组织细胞的调控。

BDNF在人类神经系统、卵巢中表达，其表达随着生殖细胞的发育而发生变化[10]。ActRⅡA属于TGF-β超家族相关信号蛋白。激活素A在细胞增殖、凋亡过程中起着重要的调节作用，可能参与胚胎植入、血管新生等过程[11]。在生殖腺中，激活素A可促进卵泡刺激素的分泌，并协同卵泡刺激素促进颗粒膜细胞分化；可抑制生长激素分泌，促进人胎盘黄体生成素释放激素和孕酮的分泌等；另外激活素A还可以促进精原细胞增殖，在精子形成初期有重要的作用。BMP-5在胚胎肢体发生及关节形成方面有重要作用，是骨、软骨组织修复的必要成分[12]。FGFRL1是成纤维细胞生长因子受体家族的新成员，可促进细胞间黏附[13]。LTBP-1是细胞外微纤维蛋白家族成员，与TGF-β结合后可调节TGF-β的分泌及激活，影响其在骨和结缔组织中的功能[14]。

3.2 与免疫系统相关 肾阳虚证与免疫系统的关系也是备受关注的研究热点。中医学认为，“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”。肾为先天之本，十二经之根，肾阳主导一身之阳气，肾阳火衰，则诸症迭出。机体内环境稳定是机体免疫功能正常的重要因素。现代中医研究显示，肾阳虚存在下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴不同环节不同程度的功能紊乱，导致机体内环境失衡，故免疫功能紊乱，疾病内生。本研究结果也证实，肾阳虚证者存在免疫调节紊乱，表现为CXC趋化因子受体3(CXCR3)、脂多糖结合蛋白(LBP)、白细胞介素27受体α(IL-27Rα)、白细胞介素13受体Ⅱα(IL-13Rα2)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、集落刺激因子-1(CSF-1)、ActRⅡA。

CXCR3是干扰素诱导的T细胞α亚族趋化因子(I-TAC)的受体，主要分布在Th1细胞和B细胞。I-TAC是T细胞最重要的趋化剂，对活化、未活化的T细胞均有趋化作用。急性期LBP具有致炎和抗炎的双重作用，既可加速脂多糖与其受体结合，放大其致炎作用，也可加速脂多糖与清除受体结合，使其被靶细胞清除[15]。IL-27Rα主要分布在外周淋巴细胞、胸腺、脾和淋巴结中[16]，具有诱导Th1反应促炎性作用和减轻炎性反应的双重免疫调节作用，但机制尚未完全明确。IL-13是由不同T细胞亚群和树突状细胞产生的细胞因子，主要由激活的辅助T淋巴细胞分泌[17]。IL-13Rα2在被炎症和细胞因子诱导后，可在脾、脑、肝、肺和胸腺组织中表达。

PECAM-1属于免疫球蛋白超家族成员[18]，其在炎症过程中通过调节与细胞迁移有关的整合素功能来诱导炎症起始期，介导细胞迁移；还可引起白细胞外渗，促进白细胞迁移。CSF-1可促进单核细胞数量的增加、吞噬功能及对细胞毒作用。激活素A作用于单核细胞，有拮抗IL-6、抑制IL-1等作用，参与机体急性期反应调节、炎症损伤及修复。

综上所述，肾阳虚证者与生长发育生殖相关的蛋白出现异常，与肾阳虚证有性欲减退，男子阳萎早泄、女子宫寒不孕等表现相符。肾阳虚证者存在明显的免疫功能紊乱，易感外邪，病后缠绵难愈，与多个蛋白表达异常相关。

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(本文编辑：曹志娟)

Study on plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency

BIJianlu*,WEIMin,SUNXiaomin,etal.

*DepartmentofEndocrinologyandNephrology,SecondHospitalofTraditionalChineseMedicineinGuangdongProvince,Guangdong,Guangzhou510095

Objective To observe the changes of plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency, to provide evidences for objective study of kidney-yang deficiency syndrome. Methods 5 subjects with kidney-yang deficiency syndrome and 6 healthy subjects were selected in our study. The differences of plasma protein expression profile were analyzed by antibody chip. Results There were 14 up-regulation protein bands between two groups. Among them, the Src protein tyrosine kinase (Csk), Frizzled 1 and 4 (FZD - 1, FZD - 4), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), activin A receptor type Ⅱ A (ActR Ⅱ A), bone morphogenetic protein 5 (BMP - 5), latent TGF-beta binding protein 1(LTBP - 1) and fibroblast growth factor receptor-like 1 (FGFRL1) were related to growth and development. And the CXC chemokine receptor 3 (CXCR3), interleukin 27 receptor alpha (IL - 27Rα) and lipopolysaccharide binding protein (LBP), interleukin 13Ⅱalpha receptors (IL - 13Rα2), colony stimulating factor 1 (CSF - 1), platelet-endothelial cell adhesion molecule (PECAM - 1) and ActR ⅡA were related to immune system. Conclusion The changes of plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency involve reproduction ability, immune response, cell apoptosis, etc. The results were correspond with the kidney-yang deficiency syndromes, such as lumbar debility, tinnitus and deafness, hair off and tooth loose, sexual hypoactivity and so on.

Kidney-yang deficiency; Protein expression profile; Embryonic development; Immunity

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.006

※ 项目来源：国家自然科学基金项目(编号：81573812)；国家自然科学基金项目(编号：81603520)；国家自然科学基金项目(编号：81673960);广东省科学技术厅省级科技计划项目(编号：2014A020221073)；广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目(编号：YQ2015035)；广州市科技计划项目(编号：201607010224)；广州市科技和信息化局广州市财政局2014年产学研专项项目(编号：2014Y2-00504)

毕建璐(1984—)，女，主治医师，博士。从事内分泌肾病科临床诊疗工作。研究方向：亚健康与肾病。

R241.6；R2-03；R349.84

A

1002-2619(2017)03-0343-05

2017-01-15)

△ 通讯作者：南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515

1 福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122

2 南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515

3 暨南大学医学院，广东 广州 510632