Ang-2及其受体Tie-2在骨肉瘤中的表达

赵小明 薛新宏 曹晓强 张会文 李军 苏立新 王振旺

·论著·

Ang-2及其受体Tie-2在骨肉瘤中的表达

赵小明 薛新宏 曹晓强 张会文 李军 苏立新 王振旺

目的 研究Ang-2及其受体Tie-2在骨肉瘤的表达情况。方法 选取唐山市第二医院2009年1月至2011年1月手术切除的69例骨肉瘤标本做为病例组。另取12例正常骨组织标本做对照组。采用RT-PCR法检测Ang-2及其受体Tie-2的表达水平。结果 骨肉瘤组Ang-2表达水平显著高于对照组(P<0.05)；骨肉瘤组Ang-2mRNA表达与Tie-2mRNA表达正相关(r=0.447，P<0.01)。结论Ang-2及其受体Tie-2参与了骨肉瘤的血管生成及调控，在骨肉瘤的发展中起着重要的作用。

骨肉瘤；血管生成素-2；血管生成素-2受体

骨肉瘤发病率居恶性骨肿瘤首位，出现血运转移较早。在很多人类恶性肿瘤的组织、体液、血液中发现Ang2表达水平均上调，与恶性肿瘤的血管密度呈正相关[1]。本研究对69例骨肉瘤患者、12例对照组和骨肉瘤细胞株MG63的表达情况，研究Ang-2和其受体Tie-2在骨肉瘤血管生成中的作用，以期为骨肉瘤发病机制研究、患者预后预测提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例采集唐山市第二医院2009年1月至2011年1月临床手术切除的69例骨肉瘤标本(OS组)。另取同期正常骨组织标本12例做对照(对照组)。Ang-2及其受体Tie-2的表达水平采用RT-PCR和Westernblot法检，；分析OS患者、正常对照组以及MG63细胞株中Ang-2表达与Tie-2的相关性。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏及培养:从液氮罐中取出安瓿并尽快解冻，放入盛有37℃水的搪瓷罐中约2～3min；取出安瓿于操作台用吸管吸出细胞悬液，移入离心管中。小心吹打使细胞悬浮，并观察细胞培养情况；采用低速离心处理，再重复用培养液漂洗、离心，最后置37℃温箱培养，第2天更换1次培养液，再继续观察培养。从培养基选取一瓶生长良好的MG63细胞，进入传代培养。先用Hank’s液洗1次；0.25%胰蛋白酶液消化液

需要从侧方加入，使细胞浸没在消化液中约1min左右；翻转培养瓶观察5～10min，细胞面如果出现了布纹孔状现象，则倒出消化液，加入一些新配制的细胞培养液，用吸管小心吹打数次，使细胞均匀分散开，按1∶3分配传代培养。

1.2.2RNA提取、RT-PCR及免疫蛋白印迹分析:RNA提取按Invitrogen公司的说明书利用Trizol进行RNA的提取，逆转录合成cDNA，然后应用PCR扩增及检测，Westernblot法做免疫蛋白印迹分析

1.3 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件，计数资料的检验采用χ2检验，计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Ang-2mRNA的表达 人骨肉瘤细胞系MG63高表达Ang-2mRNA(0.37±0.05)。骨肉瘤患者中Ang-2阳性率为81.2%，对照组阳性率为16.7%，两组Ang-2阳性率差异具有统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤组Ang-2mRNA表达水平明显高于对照组(0.35±0.12vs0.05±0.02，P<0.05)。见表1。

2.2Ang-2蛋白的表达 人骨肉瘤细胞系MG63中Ang-2蛋白显示高表达；对照组未检测到表达；骨肉瘤患者中，Ang-2蛋白的阳性率和表达量明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 Ang-2在骨肉瘤患者和对照组表达情况

注: 与对照组比较，*P<0.05

2.3 骨肉瘤中Ang-2与Tie-2表达的关系 在56例Ang-2mRNA阳性标本中，有49例Tie-2mRNA表达阳性；在13例Ang-2阴性标本中，有7例Tie-2mRNA表达阴性，对所得数据进行相关分析证实：Ang-2、Tie-2mRNA表达呈正相关(r=0.447，P<0.01)。见表2。

表2 骨肉瘤中Ang-2与Tie-2表达的关系 例(%)

3 讨论

骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性肿瘤，起源于间叶组织。它具有富含血管，肿瘤生长迅速、早期易发生血行转移的特点，因此成为肿瘤血管方面研究的重要对象[2-5]。而肿瘤的生长、浸润和转移依赖于血管生成[6]，骨肉瘤目前治疗是以扩大或根治性的截肢术为主要手段，术后辅以化疗。尽管近年来手术治疗方式和化疗药物应用已取得重大进展[7,8]，但骨肉瘤易发生多药耐药现象，其5 年生存率并没有取得明显提高[9]。因此，深入骨肉瘤分子机制研究，寻找新的治疗靶点，已成为临床亟待解决的问题。

骨肉瘤的分子机制复杂，尚有诸多机制不清楚。血管新生受多种因素调控，其中Ang-2 的表达与肿瘤进展、生长和侵袭、转移有密切联系[10,12]，在血管肉瘤、胶质瘤、胃癌、乳腺癌等研究中发现Ang-2高表达[13,14]，确立了Ang-2 在肿瘤发展和临床结局中的预测价值。目前在对肺癌、肾癌等实体瘤的研究中发现，Ang-2 可促进肿瘤细胞分泌VEGF，同样VEGF也可以促进Ang-2的分泌，Ang-2与VEGF联合作用可以使新生血管长度和增生范围增大[15,16]。

本研究对69例骨肉瘤患者、人骨肉瘤细胞系MG63和12例对照组Ang-2 表达水平进行检测，结果发现骨肉瘤患者和人骨肉瘤细胞系MG63的Ang-2表达量明显高于对照组，提示Ang-2表达与骨肉瘤密切相关；可能参与骨肉瘤患者肿瘤骨组织血管新生过程，Ang-2可能通过离断血管外周细胞，使其呈稀薄、有漏洞的形态，阻止血管进一步分化成熟，促进肿瘤血管生成和肿瘤生长。

Tie-2是Ang-2的膜受体；其表达水平间接反应Ang-2作用方式。本研究结果显示，Tie-2与Ang-2在骨肉瘤肿瘤骨组织中表达呈正相关，提示Tie-2与Ang-2可能协同参与了骨肉瘤血管生成过程。由于Ang-2即可由肿瘤细胞分泌，也可由内皮细胞产生，而肿瘤骨组织同时高表达Tie-2，提示肿瘤骨组织可能同时存有Ang-2/Tie-2的自分泌和旁分泌系统；其介导的跨膜信号转导可能正是Ang-2诱导肿瘤性血管形成、参与骨肉瘤发病过程的重要途径[17]，Tie-2是Ang-2的检测将为骨肉瘤的发病机制研究、患者预后预测提供较好的理论依据。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.037

063000 河北省唐山市第二医院(赵小明、曹晓强、张会文、李军、苏立新、王振旺)；华北理工大学附属医院(薛新宏)

薛新宏，063000 华北理工大学附属医院；

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