龙胆水提物对急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用及机制研究

2017-05-02 06:53吴军尚瑞
河北医药 2017年8期
关键词:水提物龙胆胰腺炎

吴军 尚瑞

·论著·

龙胆水提物对急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用及机制研究

吴军 尚瑞

目的 探讨龙胆水提物对急性胰腺炎(AP)大鼠肝损伤的保护作用及机制。方法 SD大鼠40只随机分为正常组(n=8)与模型组(n=32),模型组采用经十二指肠乳头逆行胆胰管注射5%牛黄胆酸钠方法制备AP大鼠模型,造模后大鼠分为4个亚组:模型对照组(n=8)、龙胆水提物12mg/kg组(n=8)、24mg/kg组(n=8)、48mg/kg组(n=8),龙胆水提物低、中、高剂量组每天分别灌胃给予龙胆水提物12mg/kg,24mg/kg及48mg/kg,正常组和模型对照组给予等体积的0.9%氯化钠溶液,连续给药1周,1次/d。给药结束后颈总动脉取血,分离血清,检测血清ALT、AST、AMY、IL-6、TNF-α水平,大鼠脱颈椎处死后剪取肝右叶1/2,于4%中性甲醛固定,HE染色观察肝脏结构变化,westernblot检测肝脏组织NF-κβ及I-κB表达水平。结果 与模型对照组比较,龙胆水提物24mg/kg及48mg/kg组血清ALT、AST、AMY水平及IL-6及TNF-α表达水平显著降低(P<0.01);肝组织NF-κβ蛋白表达水平显著降低(P<0.01),I-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论 龙胆水提物能够显著改善AP导致的肝损伤。

龙胆水提物;急性胰腺炎;肝损伤;NF-κβ;I-κB

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症之一,根据患者病情,可分为轻症胰腺炎和重症胰腺炎,轻症胰腺炎多数病程较轻,发病较缓,可自愈,急重症胰腺炎(ASP)常伴有胰外脏器损伤,其特点为胰腺实质内出现坏死、出血、发病急、进展快、死亡率高[1]。其中,以AP伴有肝功能不全或肝肾功能不全患者死亡率最高[2]。AP伴有肝损伤的主要表现在血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及淀粉酶(AMY)水平升高[3],此外,有研究发现白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平与ASP伴有肝损伤的疾病进程具有相关性[4,5]。龙胆水提物的主要成分为龙胆苦苷,龙胆苦苷具有明显的肝脏保护、抗炎、抗病原微生物、中枢兴奋及健胃利胆等作用。多项研究表明,龙胆苦苷对各种急慢性肝损伤均有明显的保护作用。本研究通过观察龙胆水提物对AP并发肝损伤模型肝损伤大鼠相关指标的影响,探讨龙胆水提物对AP大鼠肝损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级大鼠40只,雄性,体重250~300 g (武汉大学实验动物中心提供),许可证号:SCXK(鄂)2014-1254。

1.2 药物 龙胆(批号:160307812),购于康源药业股份有限公司,由湖北中医学院李明副教授鉴定为龙胆科植物龙胆正品(Gentianascabra Bunge)。

1.3 试剂及仪器 牛横胆酸钠(美国sigma公司,批号:160125);ALT、AST、AMY、IL-6、TNF-α试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司,批号分别为20160520、20160625、20160515、20160605、20160320;兔抗大鼠NF-κβ多克隆抗体、兔抗大鼠I-κB多克隆抗体及兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体均购自美国sigma公司,批号分别为160302、160521、160425;KDC-220HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司);多功能酶标仪(美国铂金埃尔默有限公司);Forma -85℃冰箱(美国Thermo公司);静脉微量注射泵(浙大医学仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 龙胆水提物制备:称取龙胆2 kg,加10倍体积水浸泡12 h后回流提取3次,每次2.5 h,提取液静止12 h后合并上清液,浓缩至8 g/ml,4℃冷藏保存,使用前稀释至所需浓度,并于室温放置2 h。

1.4.2 AP大鼠模型制备:40只SD大鼠随机分为2组:正常组(n=8)和模型组(n=32),模型组大鼠禁食不禁水12h后,10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔麻醉大鼠后固定,沿上腹正中线切口,暴露十二指肠及胰胆管,动脉夹夹闭近肝门处胰胆管,24号套管针经十二指肠乳头对侧穿刺胰胆管,动脉夹固定针头后,微量注射泵连接针头,以0.1ml/min速度注射5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g),注射完5min后,松开动脉夹,还纳十二指肠,关腹,最后皮下注射0.9%氯化钠溶液。

1.4.3 分组及给药:取模型大鼠32只分为4组,每组8只。分别为模型对照组(n=8),龙胆水提物低、中、高剂量组,龙胆水提物低、中、高剂量组每天分别灌胃给予龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg,正常组和模型对照组给予等体积的0.9%氯化钠溶液,连续给药1周,1次/d。

1.4.4 样品收集与处理:于给药结束后颈总动脉取血,4℃,3 000r/min离心分离血清,试剂盒检测ALT、AST、AMY水平,酶联免疫吸附(ELISA)检测血清IL-6、TNF-α水平,脱颈椎处死后剪取肝右叶1/2,于4%中性甲醛固定,用于HE染色,另外1/2用于westernblot检测肝脏组织NF-κβ及I-κB表达水平。所有操作均按试剂盒说明进行。

2 结果

2.1AP大鼠血清ALT、AST、AMY水平变化 与正常组比较,模型对照组ALT、AST、AMY水平显著升高(P<0.01),与模型对照组比较,龙胆水提物12 mg/kg、24 mg/kg及48 mg/kg组ALT、AST水平显著降低(P<0.05);龙胆水提物24 mg/kg及48 mg/kg组AMY水平显著降低(P<0.01),提示低、中、高剂量龙胆水提物均能改善AP大鼠血清ALT和AST水平,中、高剂量组龙胆水提物能改善AP大鼠血清AMY水平。见表1。

组别ALTASTAMY正常组89.12±15.3197.62±19.011055.21±103.27模型对照组281.42±36.71*334.17±44.85*3948.43±297.65*龙胆水提物12mg/kg组221.34±27.65#279±34.69#3411.90±243.00龙胆水提物24mg/kg组174.69±23.47△205.25±31.47△2365.42±189.32△龙胆水提物48mg/kg组137.22±19.63△167.33±45.16△1769.51±137.94△

注: 与正常组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05,△P<0.01

2.2AP大鼠血清IL-6及TNF-α表达水平变化 与正常组比较,模型对照组IL-6及TNF-α表达水平显著升高(P<0.01),与模型对照组比较,龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg组IL-6及TNF-α表达水平显著降低(P<0.05);提示低、中、高剂量龙胆水提物均能改善急性胰腺炎大鼠血清IL-6及TNF-α表达水平。见表2。

组别IL-6(pg/ml)TNF-α(ng/ml)正常组101.32±15.171.22±0.14模型对照组316.29±42.76*3.05±0.72*龙胆水提物12mg/kg组247.35±32.65#2.18±0.69#龙胆水提物24mg/kg组209.04±25.74△1.92±0.57△龙胆水提物48mg/kg组182.49±21.06△1.55±0.39△

注: 与正常组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05,△P<0.01

2.3 5组大鼠肝组织病理变化 正常组大鼠肝组织可见结构正常,细胞排列整齐,无空泡、出血、坏死及渗出浸润;模型对照组可见大量空泡,细胞排列紊乱,边界模糊不清,可见多数坏死细胞,充血及渗出浸润。与模型对照组比较,图龙胆水提物12mg/kg组,龙胆水提物24mg/kg组及龙胆水提物48mg/kg组。大鼠空泡及坏死均依次减少,细胞排列依次变整齐,边界逐渐清晰,渗出及浸润明显减少,龙胆水提物48mg/kg组最接近于正常组肝组织结构。见图1。

图1 5组大鼠肝组织病理变化

注:A:正常组;B:模型对照组;C:龙胆水提物12mg/kg组;D:龙胆水提物24mg/kg组;E:龙胆水提物48mg/kg组

2.4AP大鼠肝组织NF-κβ及I-κB蛋白表达水平 与正常组比较,模型对照组NF-κβ表达水平显著升高(P<0.01),与模型对照组比较,龙胆水提物24mg/kg及48mg/kg组NF-κβ表达水平显著降低(P<0.01);与正常组比较,模型对照组I-κB表达水平显著降低(P<0.01),与模型对照组比较,龙胆水提物12mg/kg组、4mg/kg及48mg/kg组I-κB表达水平显著升高(P<0.05)。提示龙胆水提物可以改善急性胰腺炎大鼠肝组织NF-κβ及I-κB蛋白表达水平。见图2。

图2 5组大鼠肝组织NF-κβ及I-κB蛋白表达水平(n=8)

3 讨论

AP是临床常见的急腹症之一,根据患者病情,可分为轻症胰腺炎和重症胰腺炎,轻症胰腺炎多数病程较轻,发病较缓,可自愈,ASP常伴有胰外脏器损伤,其特点为胰腺实质内出现坏死、出血、发病急、进展快、死亡率高[1]。

研究发现,并发肝损害及肝肾功能损害是导致ASP患者死亡的主要原因[2]。ASP患者出现肝损伤主要表现在血清AST、ALT及AMY升高;组织病理学改变主要为肝细胞出现空泡,充血,肿胀,坏死及渗出浸润[6-8]。本研究结果显示与模型对照组比较,龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg组ALT、AST水平显著降低(P<0.05);龙胆水提物24mg/kg及48mg/kg组AMY水平显著降低(P<0.01),提示低、中、高剂量龙胆水提物均能改善AP大鼠血清ALT和AST水平,龙胆水提物中、高剂量组龙胆水提物能改善AP大鼠血清AMY水平。

有文献研究表明,肝损害并发后,可进一步加重AP的病情,炎症的增加又反过来增加肝脏的负担,使肝损害程度加重,IL-6 是炎症急性反应期的介质,是AP判断的重要指标[9]。TNF-α是发生渗透浸润时白细胞产生的,TNF-α的大量释放是导致AP的主要原因。本研究结果显示与模型对照组比较,龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg组IL-6及TNF-α表达水平显著降低(P<0.05);提示低、中、高剂量龙胆水提物均能改善AP大鼠血清IL-6及TNF-α表达水平;肝病理组织学结构显示与模型对照组比较,龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg组及48mg/kg大鼠空泡及坏死均依次减少,细胞排列依次变整齐,边界逐渐清晰,渗出及浸润明显减少,龙胆水提物48mg/kg组最接近于正常组肝组织结构。提示龙胆水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg均能减轻AP并发肝损伤大鼠炎性反应。

很多研究认为NF-κβ的激活是炎性反应中的关键,抑制NF-κβ的激活可以显著减轻肝损伤的程度[10,11],NF-κβ的激活受到I-κB的调节,本研究结果显示,与模型对照组比较,龙胆水提物24mg/kg及48mg/kg组NF-κβ表达水平显著降低(P<0.01),龙胆水提物12mg/kg组、4mg/kg及48mg/kg组I-κB表达水平显著升高(P<0.05),提示龙胆水提物对AP导致的肝损伤的保护作用机制可能是通过I-κB/NF-κβ通路来实现的。

综上所述,龙胆水提物可明显改善由急性胰腺炎引起的肝损伤,其机制可能是是通过I-κB/NF-κβ通路来实现的。

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Protective effect and action mechanism of water extract of gentian on liver damage of rats with acute pancreatitis

WUJun,SHANGRui.

DepartmentofDigestiveSystemDiseases,People'sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicineCollege,Hubei,Shiyan442000,China

Objective To investigate the protective effect and action mechanism of water extract of gentian on liver damage of rats with acute pancreatitis (AP).Methods Forty SD rats were randomly divided into normal control group (n=8)andmodelgroup(n=32).TheanimalmodelswithAPwereestablishedbyinjecting5%cow-bezoarsodiumcholatethroughtheduodenopapillaryretrogradecholangiopancreaticduct.Aftermodeling,theratswereredividedintofoursubgroups:modelcontrolgroup,low-dosegroup(waterextractofgentian12mg/kg),median-dosegroup(24mg/kg)andhigh-dosegroup(48mg/kg),with8ratsineachgroup.Theratsinlow-dose,median-doseandhigh-dosegroupsweregivenwaterextractofgentiane12mg/kg,24mg/kg,48mg/kg,respectivelybygavage,however,theratsinnormalcontrolgroupandmodelcontrolgroupweregivenequalvolumeof0.9%sodiumchloridesolution,onceadayfor1week.Afteradministration,theserumlevelsofALT,AST,AMY,IL-6andTNF-αweredetected.Moreovertheratsweresacrificedandliverspecimensweretakenout,thechangesofliverstructurewereobservedbyHEstaining,andtheexpressionlevelsofNF-κBandI-κBinlivertissueweredetectedbyWesternBlot.Results As compared with those in model control group, the serum levels of ALT,AST,AMY, IL-6,TNF-α in median-dose group and high-dose group were significantly decreased (P<0.01),andtheexpressionlevelsofNF-κβproteinwereobviouslydecreasedtoo(P<0.01),however,theexpressionlevelsofI-κBproteinweresignificantlyincreased(P<0.01).Conclusion The water extract of gentian can obviously improve the liver damage caused by acute pancreatitis in rats.

water extract of gentian; acute pancreatitis; liver damage; NF-κβ; I-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.005

442000 湖北省十堰市,湖北医药学院附属人民医院消化内科

尚瑞,442000 湖北省十堰市,湖北医药学院附属人民医院消化内科;

E-mail:shangree@126.com

R

A

1002-7386(2017)08-1141-04

2016-08-21)

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