川崎病动物模型弓动脉中VEGF/PTEN/PI3K信号通路的表达研究

傅鸣郁 张海宁 田静 牛玲 何秀华 王庆文 王燕 李春利 王镇洲 安新江

·论著·

川崎病动物模型弓动脉中VEGF/PTEN/PI3K信号通路的表达研究

傅鸣郁 张海宁 田静 牛玲 何秀华 王庆文 王燕 李春利 王镇洲 安新江

目的 观察川崎病幼兔模型VEGF/PTEN/PI3K信号通路变化，探讨其可能的机制。方法 随机将40只幼兔分为正常组(10只)和模型组(30只)，模型组按照2.5 ml/kg的剂量，分别于第1天和第14天耳缘静脉注射10%牛血清白蛋白，正常组给予等量0.9%氯化钠溶液注射。分别于造模完成后第1、7、30天收集家兔血清，弓动脉，检测血清白细胞、CK、VEGF水平，HE染色观察各组幼兔弓动脉组织形态学变化，免疫组化染色观察弓动脉PTEN、PI3K表达情况。结果 与正常组比较，模型组幼兔，造模后第1天，血清VGEF水平显著升高，表明体内发生炎症反应，而到第7天，VEGF水平呈下降趋势(P<0.01)，至第30天，水平恢复至正常幼兔水平。免疫组化结果显示，与正常组比较，在造模后第1天，弓动脉内PTEN表达开始增强，造模后第7、30天，弓动脉内PTEN表达显著增强(P<0.01)，而PI3K表达则逐渐减少(P<0.01)。结论VEGF/PTEN/PI3K信号通路与川崎病的发生、发展有着密切联系。

川崎病;幼兔;VEGF;PTEN;PI3K

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种好发于幼儿中等大小动脉的急性炎症性血管炎，且可导致对脏器损伤，是后天性心脏病的主要病因，严重者可导致冠状形成冠状动脉瘤，引起心肌梗死，但其目前主要病因的及发病机制尚不清楚[1,2]。目前研究认为川崎病的发病主要与感染、遗传和免疫系统的异常有主要关系，认为T细胞和B细胞的异常激活等可导致大量炎性介质、细胞因子释放，导致血管内皮损伤[3]。本研究采用牛血清白蛋白静脉注射复制家兔实验性血管炎模型，在造模的早期、中期和恢复期对家兔血清VEGF水平进行检测，同时对调控VEGF的PTEN/PI3K信号通路进行研究，旨在探讨PTEN/PI3K/VEGF通路在川崎病不同阶段的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 日本大耳幼兔(简称幼兔)40只，3～4周龄，体重(800±50)g，雌雄不拘，购自沈阳药科大学，许可证号：SCXK(辽)2014-0002。

1.2 试剂与药物 牛血清白蛋白(批号A8020，北京Solarbio公司产品)，鼠抗兔VEGF ELISA试剂盒(美国Cloud-Clone Corp)，鼠抗兔PTEN多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，鼠抗兔PI3K单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)。

1.3 主要仪器 石蜡切片机(RM-2235，德国Leisa)，生物组织石蜡包埋机(YB-6LF)，Olympus光学显微镜(BX-41，日本Olympus公司)，Image ProPlus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司)。

1.4 方法

1.4.1 分组、造模及取材:40只随机分为正常组(10只)和模型组(30只)。模型组按照2.5 ml/kg的剂量，分别于第1天和第14天耳缘静脉注射10%牛血清白蛋白。正常组给予等量0.9%氯化钠溶液注射。于造模完成后第1、7、30天分别采集耳缘静脉血2 ml于灭菌后试管，4℃放置30 min，3 000 r/min离心10 min，将收集的血清分装后于-80℃冰箱保存。于第1、7、30天，采血后，腹腔麻醉取材，分离心脏，留取弓动脉，分别保存于4%多聚甲醛和-80℃冰箱待测。

1.4.2 检测指标及方法

1.4.2.1 血清血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平检测:ELISA法检测幼兔血清VEGF水平，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.2.2 血清CK、白细胞水平检测:全自动生化分析仪检测幼兔血清CK、白细胞水平。

1.4.2.3 弓动脉组织形态学检测:弓动脉组织4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按苏木素-伊红(HE)染色常规方法进行70%～100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(切片厚度为5 μm)、贴片、烤片后，用二甲苯脱蜡、70%～100%梯度乙醇复水、苏木精染色、70%盐酸乙醇分色、伊红复染后，再用70%～100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片石蜡包埋，光学显微镜下观察肝脏组织形态。

1.4.2.4 免疫组化检测:按照上述步骤对组织进行切片、脱蜡。切片用0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次，用0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性15 min，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次，正常血清室温孵育切片30 min，防止抗体的非特异性吸附，用特异性鼠抗兔抗体(PTEN，1∶50；PI3K，1∶100)孵育切片，4℃下湿盒内孵育过夜，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次。用针对一抗的生物素标记的二抗(1∶200)室温孵育切片30 min，0.01 mol/L PBS冲洗min，3次，滴加SP试剂，室温下孵育20 min，用0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次，DAB显色10 min后，用0.01 mol/L PBS冲洗切片终止显色反应，切片脱水，透明，中性树胶封片。

2 结果

2.1 川崎病家兔模型在造模后第1、7、30天血清白细胞、CK、VEGF水平变化 与正常组比较，模型组白细胞水平显著升高(P<0.05或<0.01)，以第7天升高较为明显，模型组第7、30天CK水平明显升高，模型组第1天VEGF水平显著升高，随后至第30天呈现下降趋势并回到正常水平左右。见表1。

表1 川崎病家兔模型在造模后第1、7、30天血清白细胞、CK、VEGF变化情况 ±s

注: 与正常组组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.2 4组幼兔弓动脉病理组织形态学改变HE染色结果提示，正常组弓动脉结构清晰，管腔大小适中，薄厚均一，川崎病家兔模型在造模后第1天管壁变形，略增厚，管腔增大，造模第7天可见管壁变形，略增厚，管腔增大，第30天HE染色冠状动脉的管壁逐渐变薄、变形、管腔增大。见图1。

2.3 弓动脉PTEN免疫组化染色结果 弓动脉免疫组化结果显示，与正常组比较，在造模后第1天，弓动脉内PTEN表达增强，但无统计学意义(P>0.05)，造模后第7、30天，弓动脉内PTEN表达显著增强(P<0.01)，与造模后第1天比较，造模后第30天，弓动脉内PTEN表达显著增强(P<0.01)。见图2。

2.4 弓动脉PI3K免疫组化染色结果 弓动脉免疫组化结果显示，与正常组比较，在造模后第1天，弓动脉内PI3K表达减弱，但无统计学意义(P>0.05)，造模后第7、30天，弓动脉内PI3K表达显著减弱(P<0.01)，与造模后第1天比较，造模后第30天，弓动脉内PI3K表达显著减弱(P<0.01)。见图3。

3 讨论

川崎病是以全身中小动脉血管炎为主要病理改变的急性发热、出疹性疾病，好发于5岁以下儿童及幼儿，临床表现为发热、不同程度口腔黏膜改变、皮疹、眼结膜充血、手足指端改变等，严重者可累及多系统和脏器[4]。近年来，川崎病的发病率逐年升高，已成为小儿后天性心脏病的主要发病原因，但其病因病机尚不明确，因此，对于川崎病的发病机制研究显得尤为重要。本研究利用牛血清白蛋白静脉注射引起家兔免疫损失，进而复制幼兔实验性血管炎模型，通过病理检测和血清水平检测显示，与正常组比较，模型组幼兔弓动脉呈现川崎病症状改变，不同时间段的动物模型也分别呈现出急性期、缓解期的病理改变，我们发现这种造模方法复制出的模型与人类疾病非常相近，为后续研究打下有力保障。

图1 4组幼兔弓动脉HE染色结果

注:A正常组;B造模第1天;C造模第7天;D造模第30天

图2 川崎病家兔模型弓动脉PTEN免疫组化染色结果

注:A正常组;B造模第1天;C造模第7天;D造模第30天

图3 川崎病家兔模型弓动脉PI3K免疫组化染色结果

注:A正常组;B造模第1天;C造模第7天;D造模第30天

VEGF主要由血管平滑肌释放渗透性细胞因子，在炎症反应时释放，是一个通过刺激内皮细胞上同系受体介导的多重功能的多效的生长因子[5]，可诱导促进裂隙胶原酶及金属蛋白酶的合成，加速小静脉和毛细血管出现裂隙，还可诱导内皮细胞黏附分子表达，造成周围血管水肿，在川崎病发病中参与动脉的损伤。张琦等[6]研究发现，川崎病患儿急性期血清VEGF水平显著升高，明显高于正常组和缓解期，认为VEGF在川崎病的发病过程中发挥重要重要。

磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K/AKT)是细胞内生命活动的关键信号分子，与细胞的生长、增殖有着密切关系，PI3K长期处于活化状态能促进细胞的侵袭与转移，已有研究表明PI3K与多种癌细胞的增殖分化有着密切关系，同时与CEGF水平有着密切关系，张涓娟等[7]研究证实，抑制PI3K/AKT细胞信号通路能够下调VEGF蛋白表达。PTEN是一个作用于酪氨酸残基的去磷酸化蛋白，通过对PIP3蛋白的负性调节，进而拮抗PI3K的活性，对PI3K/AKT通路进行负调控，若PTEN失活，PI3K/AKT持续活化，导致细胞分裂、体积增大、凋亡阻滞和肿瘤血管生成等[8]。本研究通过检测幼兔血清VEGF水平，以及弓动脉PI3K和PTEN的表达水平，观察川崎病发病的可能机制。

研究结果显示，与正常组比较，模型组幼兔，造模后第1天，血清VGEF水平显著升高，表明体内发生炎症反应，而到第7天，VEGF水平呈下降趋势(P<0.01)，至第30天，水平恢复至正常幼兔水平。免疫组化结果显示，与正常组比较，在造模后第1天，弓动脉内PTEN表达开始增强，造模后第7、30天，弓动脉内PTEN表达显著增强(P<0.01)，而PI3K表达则逐渐减少(P<0.01)，说明川崎病的发生、发展与VEGF/PTEN/PI3K信号通路有着密切联系，但其具体机制有待进一步探讨。

1 邓永超，王勋，唐喜春，等.儿童川崎病并发冠状动脉损害的危险因素分析.中国当代儿科杂志，2015，17：927-931.

2 王倩，赵建美.川崎病病因与发病机制的研究进展.实用医学杂志，2015，31：2595-2597.

3 黄春琳，莫艺璇.川崎病发病机制研究进展.医学综述，2013，19：1753-1755.

4 石世明，廖燕玲.川崎病病因、诊断及治疗的研究进展.中外医学研究，2015，13：155-157.

5 段泽星，谢立群.VEGF在肿瘤生长和血管生成中的作用.世界华人消化杂志，201，18：2894-2900.

6 张琦，徐莉敏，丁曙霞.川崎病患儿血清VEGF和NO水平变化及临床意义.医学研究杂志，2007，36：100-102.

7 张涓娟，蒲宇，李勇，等.PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路对胰腺癌PANC-1细胞VEGF表达的影响.川北医学院学报，2014，29：44-48.

8KawasakiT.Acutefebrilemuco-cutaneouslymphnodesyndromeinyoungchildrenwithuniquedigitaldesquamation.JpnJAllergol，1967，16：178-222.

The expression of PTEN/PI3K/VEGF signaling pathway in arch artery of animal models with Kawasaki disease

FUMingyu,ZHANGHaining,TIANJing,etal.

DepartmentofVasculocardiology,Children’sHospitalofXuzhouCity,Jiangsu,Xuzhou221006,China

Objective To observe the changes of VEGF/PTEN/PI3K signal pathway in young rabbit model with Kawasaki disease,and to explore its possible mechanism.Methods Forty young rabbits were randomly divided into control group (n=10)andmodelgroup(n=30),Therabbitsinmodelgroupwereintravenouslyinjectedwith10%bovineserumalbuminat1dand14d(2.5ml/kg)toestablishtheanimalmodelswithKawasakidisease,however,therabbitsincontrolgroupweregiventhesamevolume0.9%sodiumchloridesolutionbyintravenousinjection.Thespecimensofserumandarcharterywerecollectedat1d,7dand30daysaftermodeling.thesermlevelsofWBC,CKandVEGweremeasured,andthemorphologicalchangesofarcharterywereobservedbyHEstaining,moreover,theexpressionlevelsofPTENandPI3Kinarcharteriesweredetectedbyimmunohistochemicalstaining.Results As compared with those in control group,on the first days after modeling,the serum levels of VGEF in model group were significantly increased,which indicated that there was an inflammatory reaction in the body of rabbits,however, on the 7th day after modeling, the serum levels of VEGF were obviously decreased (P<0.01),untilthe30thdayaftermodeling,VEGFlevelswererecoveredtonormallevel.Immunohistochemicalresultsshowedthatonthefirstdayaftermodeling,theexpressionlevelsofPTENinarcharterywereincreased,moreover,onthe7thdayand30thdayaftermodeling,theexpressionlevelsofPTENweresignificantlyincreased(P<0.01),however,theexpressionlevelsofPI3Kweregraduallydecreased(P<0.01).Conclusion The VEGF/PTEN/PI3K signaling pathway is closely related to the pathogenesis and development of Kawasaki disease.

Kawasaki disease;young rabbits;VEGF;PTEN;PI3K

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.002

项目来源：徐州市科技计划项目(编号：XM12B053)

221006 江苏省徐州市儿童医院心血管内科

安新江，221006 江苏省徐州市儿童医院心血管内科；

E-mail:ajjsxz@163.com

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1002-7386(2017)08-1129-04

2016-12-05)