IL-6在巨噬细胞向M2型极化过程中的诱导作用

刘苗 唐荣 姜毅

·论著·

IL-6在巨噬细胞向M2型极化过程中的诱导作用

刘苗 唐荣 姜毅

目的 将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞和骨髓瘤细胞系KM3细胞共培养，探讨IL-6在巨噬细胞向M2型极化的过程的作用。方法 取对数生长期细胞，分为3组：A组(KM3细胞组)，B组(RAW264.7细胞组)，C组(RAW264.7细胞+KM3细胞组)。分别予以ACTA(IL-6特异性抑制剂激活素A)或rIL-6(重组人IL-6)处理后，检测肿瘤相关M2型巨噬细胞表达标志F4/80+ CD206+的比例。RT-PCR和Westernblot方法检测各组细胞因子CCL22、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA和蛋白表达量。ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-6的含量。结果 RAW264.7和KM3细胞共培养24 h后，与对照组相比，M2 型巨噬细胞比例显著增加(P<0.05)；予以ACTA处理后M2型巨噬细胞表达明显下降(P<0.05)；而予以rIL-6处理后M2型巨噬细胞表达明显上调(P<0.05)。与B组(RAW264.7细胞组)相比，C组(RAW264.7细胞+KM3细胞)M2型巨噬细胞相关细胞因子CCL22，IL-10的mRNA和蛋白表达水平明显上调(P<0.05)，而M1型巨噬细胞相关因子IL-12，TNF-α的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。与A组、B组相比，C组细胞上清液中IL-6含量在24 h、48 h、72 h时间点均明显上调(P<0.05)。通过浓度梯度改变RAW264.7细胞或KM3细胞的数量，发现RAW264.7细胞数量的改变显著影响了IL-6的表达水平。结论 将RAW264.7细胞和KM3细胞共培养后，后者能诱导RAW264.7细胞向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化， IL-6在上述转化过程中发挥重要作用。

巨噬细胞；骨髓瘤；IL-6；极化

白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，能调节多种生理功能，包括基因激活、细胞增殖和分化[1,2]。近年来，大量的研究表明IL-6参与了多种肿瘤的进展过程，促进肿瘤细胞生长，是恶性肿瘤预后不良的重要标志[3,4]。M2型巨噬细胞是肿瘤组织中数量最多的抗原提呈细胞，其在肿瘤的发展、浸润、转移及促进肿瘤血管生成中发挥重要作用。有研究表明，IL-6与巨噬细胞极化相关[5,6]。本研究将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞和骨髓瘤细胞系KM3细胞作为研究对象，探讨IL-6是否参与了巨噬细胞向M2型极化的过程。

1 材料与方法

1.1 试剂 新生牛血清及IMEM培养基购于Gibco公司，PI标记的抗小鼠F4/80抗体和FITC标记的抗小鼠CD206抗体购自eBioscience公司，Trizol试剂盒购于上海生工生物有限公司,RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司，相关一抗体(CCL22、IL-10、IL-12、TNF-α多克隆抗体)购自Cell signal公司，相应二抗体购自Pierce公司，IL-6特异性抑制剂激活素A及鼠源重组白细胞介素6(rIL-6)购自辉瑞公司，蛋白电泳marker购自Fermentas公司。ELISA试剂盒购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：RAW264.7细胞 和KM3细胞购自华中科技大学同济医学院基础学院，RAW264.7细胞 和KM3细胞分别在IMEM培养基(含10%Gibco新生牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)中常规培养。

1.2.2 实验分组：实验分为：A组：KM3细胞组，B组：RAW264.7细胞组，C组：RAW264.7细胞+KM3细胞组，RAW264.7细胞接种于6孔板的数目为1×105/孔， KM3细胞接种于6孔板的数目为5×105/孔。

1.2.3 流式细胞术检测：各组细胞培养24 h后，检测肿瘤相关M2型巨噬细胞表达标志F4/80+ CD206+的比例。将C组细胞分为2组，D组：RAW264.7细胞+KM3细胞+ ACTA(IL-6特异性抑制剂激活素A)；E组：RAW264.7细胞+KM3细胞+ rIL-6(重组人IL-6)。通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞的比例。采用PI标记F4/80抗体，FITC标记CD206抗体。

1.2.4 RT-PCR方法：检测各组CCL22、IL-10、IL-12、TNF-α基因mRNA表达收集各组细胞，提取总RNA，检测各组细胞因子CCL22、IL-10、IL-12、TNF-α的mRNA 表达。方法如下：①逆转录：根据Trizol一步法抽提总RNA，分光光度计测定RNA浓度。将抽提的总RNA为模板，以Oligo(dT)15为反转录引物，各样品取相同量的RNA逆转录成cDNA。②PCR扩增： 设计引物，取PCR产物8 μl,加5× Loading buffer 2 μl,2%琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，凝胶成像仪成象，并对电泳条带进行分析。

1.2.5 Westernblot方法：检测各组CCL22、IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表达收集各组细胞进行以下实验。①蛋白抽提与定量:各组细胞加入200 μl蛋白裂解液，混匀，充分裂解后提取总蛋白。②免疫印迹检测目的蛋白:配置SDS-PAGE浓缩胶与分离胶，本实验浓缩胶为3.9%, 分离胶为8%和10%,凝胶聚合1 h。在电泳缓冲液中进行电泳，然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。在5%脱脂奶粉中进行抗体封闭，然后加入相应的一抗：CCL22(1∶2 000)，IL-10(1∶2 500)，IL-12(1∶2 000)，TNF-α(1∶1 000)4℃冰箱过夜后，将硝酸纤维素膜用TBST液反复冲洗，再加入相应的二抗，摇床摇1 h后取出，TBST液反复冲洗，并以兔抗GAPDH(1∶1 000)作为对照。随后进行显影及曝光，计算蛋白条带的吸光度值(IA=平均吸光度×面积)。

1.2.6 ELISA方法检测:①取各组细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定细胞因子IL-6含量；②取RAW264.7细胞和KM3细胞，按照细胞混合比例不同，分为8组，C1：RAW264.7细胞数为 1×105/孔,KM3细胞数为5×105/孔； C2:RAW264.7细胞数为1×105/孔； KM3细胞数为2.5×105/孔; C3:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为1.25×105/孔; C4:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为0.625×105/孔; C5:KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为1×105/孔; C6:KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.5×105/孔; C7:KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.25×105/孔; C8:KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.125×105/孔。培养24 h后取上清液，测定IL-6的含量。

2 结果

2.1 流式细胞术检测结果 培养24 h后，A组和B组仅可见少量(2.46%,2.37%)M2型巨噬细胞表达。与A组和B组相比，C组M2型巨噬细胞(10.35%)比例显著增加，差异有统计学意义(t=4.379,P<0.05;t=3.726,P<0.05)。干预24 h后，D组M2型巨噬细胞表达的比例为1.07%，与C组相比，D组M2型巨噬细胞表达明显下降(t=5.201,P<0.05); E组M2型巨噬细胞表达的比例为25.12%，与C组相比，E组M2型巨噬细胞表达明显上调(t=3.592,P<0.05)。见图1，表1。

2.2 RT-PCR检测结果 与B组比较，C组的M2型巨噬细胞相关细胞因子CCL22，IL-10的mRNA表达水平明显增高(t=2.993,P<0.05;t=4.162,P<0.05)，而M1型巨噬细胞相关因子IL-12，TNF-α的mRNA表达水平降低(t=3.386,P<0.05;t=4.359,P<0.05)。见图2，表2。

A组B组C组D组E组

图1 干预24 h后不同细胞组肿瘤相关M2型巨噬细胞表达的比例

注: 与KM3细胞组比较,*P<0.05；与RAW264.7细胞组比较,#P<0.05;与RAW264.7细胞+KM3细胞比较,△P<0.05

图2 RT-PCR 电泳结果

M:marker：1：RAW264.7细胞组， 2：RAW264.7细胞+KM3细胞

指标RAW264.7细胞组RAW264.7细胞+KM3细胞组F值P值CCL220.4236±0.01280.5367±0.0239*5228.689<0.05IL-10 0.7269±0.03230.8642±0.0156*4529.332<0.05IL-12 0.5717±0.01960.3673±0.0241*3274.126<0.05TNF-α0.6425±0.03340.4565±0.0183*5176.457<0.05

注: 与RAW264.7细胞组比较,*P<0.05

2.3Westernblot检测结果 与B组比较，C组的M2型巨噬细胞相关细胞因子CCL22，IL-10的蛋白表达水平明显增高(t=4.302,P<0.05;t=5.265,P<0.05)，而M1型巨噬细胞相关因子IL-12，TNF-α的蛋白表达水平降低(t=3.889,P<0.05;t=4.747,P<0.05)。见图3，表3。

2.4 ELISA检测结果 与A组、B组相比，C组细胞上清液中IL-6含量在24 h、48 h、72 h时间点均明显上调(P<0.05),在72 h时，结果示C组IL-6的含量是A组2.61倍，B组2.35倍。见图4，表4。

图3 Western blot 电泳结果

注: 1：RAW264.7细胞组;2：RAW264.7细胞+KM3细胞

指标RAW264.7细胞组RAW264.7细胞+KM3细胞组F值P值CCL220.3757±0.02210.4809±0.0178*3377.657<0.05IL-10 0.6524±0.01950.8715±0.0269*5903.332<0.05IL-12 0.6063±0.03460.5126±0.0332*4041.256<0.05TNF-α0.9356±0.02730.8177±0.0247*2832.747<0.05

注: 与RAW264.7细胞组比较,*P<0.05

图4 3组细胞上清液中IL-6表达水平

注:A：KM3细胞组，B：RAW264.7细胞组，C：RAW264.7细胞+KM3细胞

干预时间KM3细胞组RAW264.7细胞组RAW264.7细胞+KM3细胞组24h11.5623±0.536615.3447±0.675820.1892±0.3139*#48h13.1145±0.678216.8361±0.559425.2123±0.2775*#72h17.5523±0.499519.4943±0.394645.8115±0.4138*#

注: 与KM3细胞组比较,*P<0.05;与RAW264.7细胞组比较,#P<0.05

C2组、C3组、C4 组IL-6的表达水平分别为C1 组的92.1%,91.2%,85.7%,仅C4组与C1组的差异有统计学意义(t=4.634,P<0.05)。C6组,C7组,C8组IL-6的表达水平分别为C5 组的66.7%,57.8%,46.5%,差异均有统计学意义(t=4.208,P<0.05;t=5.537,P<0.05;t=3.901,P<0.05)。见图5，表5、6。

图5 不同比例混合的共培养细胞上清液中IL-6表达水平

注: C1:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为5×105/孔; C2:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为2.5×105/孔;C3:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为1.25×105/孔;C4:RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为0.625×105/孔;C5: KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为1×105/孔;C6: KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.5×105/孔;C7: KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.25×105/孔;C8: KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为0.125×105/孔

3 讨论

细胞因子IL-6参与了机体多种功能，研究发现，IL-6与肿瘤的发生及发展密切相关，IL-6参与了恶性肿瘤的免疫逃逸，是恶性肿瘤预后不良的重要标志[7,8]。研究表明，降低IL-6的活性能够恢复骨髓瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。

巨噬细胞的激活状态主要分为两种类型：M1型和M2型。 M1型巨噬细胞主要由Th1型细胞因子激活，表现为高表达MHCII，产生大量TNF-α、IL-12和NO，可直接杀伤病原微生物和肿瘤细胞，M1型巨噬细胞参与促炎反应，具有免疫监视作用[10,11]。M2型巨噬细胞主要由Th2型细胞因子激活，其表达标志主要为F4/80+ CD206+，通过分泌抑制性细胞因子IL-10、CCL22、TGF-β等下调机体的免疫应答，M2型巨噬细胞与抗炎反应及肿瘤疾病相关[12,13]。研究发现，M2型巨噬细胞在在肿瘤的发展、浸润、转移及促进肿瘤血管生成中发挥重要作用[14，15]。

炎症微环境在肿瘤的进展中发挥着重要作用，巨噬细胞是肿瘤微环境中浸润炎性细胞的主要成分。肿瘤细胞周围基质中分泌的细胞因子和酶构成的局部微环境，决定了巨噬细胞的类型和功能。研究表明，肿瘤微环境中相关细胞因子IL-6能诱导巨噬细胞向M2型极化，后者广泛参与了肿瘤的免疫逃逸[16-18]。

表5 不同比例混合的共培养细胞上清液中IL-6表达水平 ±s

注: 与C1组(RAW264.7细胞数为1×105/孔,KM3细胞数为5×105/孔)比较，*P<0.05

表6 不同比例混合的共培养细胞上清液中IL-6表达水平 ±s

注: 与C5组(KM3细胞数为5×105/孔，RAW264.7细胞数为1×105/孔)比较,*P<0.05

本研究显示，KM3细胞与RAW264.7细胞共培养后，M2型巨噬细胞所占比例增加，CCL22、IL-10等M2型细胞因子表达水平上调，IL-12、TNF-α等M1型细胞因子表达水平下调，提示KM3细胞能诱导RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞转化。通过对RAW264.7向M2型巨噬细胞转化的分子机制深入研究发现， 当RAW264.7细胞和KM3细胞共培养后，培养上清液中IL-6高表达。研究发现，多种肿瘤细胞分泌IL-6，暴露于IL-6或者自分泌IL-6的癌细胞具有较强的侵袭力和抗药性。

本研究通过浓度梯度改变RAW264.7细胞或KM3细胞的数量，观察IL-6表达量的变化，旨在分辨IL-6主要是由何种细胞分泌。结果发现，C2、C3、C4组的浓度分别是C1 组的92.1%、91.2%、85.7%，仅C4组与C1组的差异有统计学意义(P<0.05)， C6、C7、C8组的浓度分别是C5组的66.7%、57.8%、46.5%, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明IL-6的表达主要受RAW264.7细胞数量影响更为明显，我们推测IL-6主要通过RAW264.7细胞分泌。进一步研究发现，激活素A(IL-6特异性抑制剂)能抑制RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞转化，重组IL-6能促进上述转化过程。

总之，本研究初步证实骨髓瘤细胞能诱导巨噬细胞向M2型转化，IL-6参与了上述过程，其具体机制仍需进一步研究。

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The induction effect of IL-6 in polarization process of macrophages to M2 type in vitro

LIUMiao,TANGRong,JIANGYi.

DepartmentofPaediatrics,People’sHospitalAffiliatedtoWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Objective To investigate the effects of IL-6 in polarization process of macrophages to M2 type,with macrophage cell line-RAW264.7 of mice being co-cultured with myeloma cell line KM3 in vitro.Methods The cells at exponential growth phase were divided into three groups: group A (KM3 cell),group B (RAW264.7 cell),group C (RAW264.7 cell +KM3 cell).After the cells were treated with ACTA (a specific inhibitor of IL-6) or rIL-6 (recombinant human IL-6),respectively,the proportion of F4/80+ CD206+ cells was detected. The expression levels of CCL22, IL-10, IL-12, TNF-α lpha were measured by RT-PCR and Western Blot, respectively. The content of IL-6 in culture supernatant was detected by ELISA.Results After RAW264.7 cells and KM3 cells were co-cultured for 24 hours, as compared with that in control group, the proportion of M2 type macrophages was significantly increased (P<0.05),moreoverafterthecellsweretreatedbyACTA,theexpressionofM2typemacrophageswasobviouslydecreased(P<0.05),however,afterthecellsweretreatedbyrIL-6,theproportionofM2macrophageswassignificantlyincreased(P<0.05).AscomparedwiththoseingroupB,theexpressionlevelsofM2macrophagerelatedcytokines-CCL22andIL-10mRNAandproteinweresignificantlyup-regulatedingroupC(P<0.05),buttheexpressionlevelsofM1macrophagerelatedcytokines-IL-12,TNF-αlphamRNAandproteinwereobviouslydown-regulated(P<0.05).AscomparedwiththoseingroupAandgroupB,thelevelsofIL-6inculturesupernatantweresignificantlyincreasedat24h, 48h, 72htimepointsingroupC(P<0.05).WhenthecellcountsofRAW264.7cellsorKM3cellswerechangedbydifferentconcentrationgradient,theexpressionlevelsofIL-6weremoreeasilyinfluencedbythechagesofRAW264.7cellnumber.Conclusion After RAW264.7 cells are co-cultured with KM3 cells in vitro, the latter can induce the transformation of RAW264.7 cell into tumor-associated M2 macrophages, moreover, IL-6 may play an important role in the transformation process.

macrophage；myeloma；IL-6；polarization

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.001

项目来源：湖北省自然科学基金项目(编号：2014CFB395)

430060 湖北省武汉市,武汉大学人民医院儿科

姜毅，430060 湖北省武汉市,武汉大学人民医院儿科;

E-mail: jiangyiwd@126.com

R 730.2

A

1002-7386(2017)08-1125-05

2016-12-13)