miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达变化及临床意义

邵田

·论著·

miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达变化及临床意义

邵田

目的 探讨miR-15a在子宫内膜癌组织中表达变化及临床意义，分析miR-15a在子宫内膜癌发生发展过程中的可能机制。方法 通过荧光定量PCR法测定68例子宫内膜癌组织和68例癌旁组织的miR-15a表达情况；分别将无关序列模拟物(非转染组)、miR-15a模拟物(转染组)转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞，设立阴性对照组，比较3组的miR-15a和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达情况；并通过Transwell肿瘤细胞侵袭试验和Transwell肿瘤细胞迁移试验检测RL95-2细胞的侵袭力和迁移能力。结果 子宫内膜癌组织miR-15a相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.05)； miR-15a相对表达量与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润程度、分化程度相关(P<0.05)；转染组miR-15a相对表达量明显高于未转染组和对照组，MMP-2相对表达量明显低于未转染组和对照组(P<0.05)；转染组侵袭力与迁移力均明显低于未转染组和对照组(P<0.05)。结论 在子宫内膜癌患者中miR-15a以低表达为主，且与淋巴结转移、分化程度、肌层浸润程度、FIGO分期有关，miR-15a作为抑癌基因可能是通过抑制MMP-2蛋白发挥抑制癌细胞转移及侵袭的作用。

子宫内膜癌；miR-15a；表达水平；转移侵袭；分析

子宫内膜癌是对女性群体身心健康和生命威胁极大的恶性肿瘤之一，病死率及发病率呈现出逐年上升，且有趋向年轻化的趋势[1]。近几年，分子生物学标记物在恶性肿瘤患者诊断及预后评估中得到了广泛应用。微小RNAs(miRNA)为内源性小分子RNA的一种，在转录水平上能够调控相关基因表达来起到调节生物学功能的作用[2]。相关研究指出，miRNA与细胞的凋亡、生长、增殖等过程有关，而且与恶性肿瘤、肝胆疾病、心血管疾病等的发生及进展有一定关系[3,4]。其中，miR-15a为miRNA家族中的一个重要成员，属于一种较为保守的miRNA，无法直接无法编码相关蛋白。部分研究显示，miR-15a与肺癌、结肠癌等的转移、浸润过程密切相关[5]。基于此，本研究探讨了miR-15a在子宫内膜癌组织中表达变化及临床意义，分析miR-15a在子宫内膜癌发生发展过程中的可能机制。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年5月至2016年5月我院收治的子宫内膜癌患者的资料，病历资料完整且取得子宫内膜癌组织和癌旁组织石蜡切片的患者纳入本研究，共入选68例患者。入选标准：(1)均行手术治疗；(2)行手术治疗前均未进行放化疗或者其他辅助治疗；(3)病历资料保存完整者。排除标准：(1)伴有远处转移者；(2)复发患者。68例患者中，年龄48～73岁，平均年龄(55.9±7.2)岁；国际妇产科联盟(FIGO)制定的分期[6]：Ⅰ期18例，Ⅱ期26例，Ⅲ期14例，Ⅴ期10例；分化程度：G1者31例，G2者23例，G3者14例；病理类型：子宫内膜样内膜癌61例，浆乳癌或透明细胞癌7例；肌层浸润深度：≤1/2者51例，>1/2者17例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移53例。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂:RL95-2人子宫内膜癌细胞(上海康朗生物科技有限公司生产)，实时荧光定量PCR仪及其试剂盒(美国BioRad公司生产)，LipofectamineTM2000细胞转染试剂盒、总RNA提取试剂盒TRIzol(美国Roche公司生产)，0.25%胰酶、PBS、DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司生产)，miR-15a片段的设计与合成由上海研域生物工程有限公司完成，NanoDrop2000 型紫外分光光度计(美国Merinton公司生产)。

1.2.2 子宫内膜癌组织与癌旁组织miR-15a检测:通过荧光定量PCR法测定子宫内膜癌组织和癌旁组织的miR-15a表达情况，取总RNA提取试剂盒对子宫内膜癌组织和癌旁组织的RNA进行提取，取紫外分光光度仪检测所提取RNA的浓度及纯度，A260/A280值≥1.8的样品进行测定；把RNA逆转录合成为cDNA，进行miR-15a基因扩增，以U6作为内参行定量PCR法检测，上游因为为5’-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3’，下有引物为试剂盒中通用引物；取PCR仪进行PCR测定，反应程序为90℃变性60 s，95℃变性10 s，74℃变性15 s，共进行36个循环，以2-ΔΔCt计算子宫内膜癌组织和癌旁组织的miR-15a的相对表达量。所有试验均重复3次。

1.2.3 RL95-2细胞培养和miR-15a基因的转染:取RL95-2细胞株放于DMEM培养基中，置于5% CO2培养箱进行培养，温度控制在37℃，取0.25%胰酶进行消化和传代，以对数生长细胞进行转染；分别将无关序列模拟物(非转染组)、miR-15a模拟物(转染组)转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞，严格按照LipofectamineTM 2000细胞转染试剂盒说明进行，设立阴性对照组，转染8 h后把所有细胞放置于培养基中培养。所有试验均重复3次。

1.2.4 RL95-2细胞miR-15a检测:通过荧光定量PCR法测定RL95-2细胞miR-15a的相对表达量，取总RNA提取试剂盒提取转染48 h的RL95-2细胞，余步骤和相对表达量计算参照1.2.2进行。所有试验均重复3次。

1.2.5 RL95-2细胞侵袭能力检测:通过Transwell肿瘤细胞侵袭试验对RL95-2细胞侵袭能力进行测定，将保存于-20℃冰箱中的基质胶取出后于4℃下过夜融化，取培养基将其稀释至1 mg/ml，取50 μl的培养基经孵育后凝固备用；将4×105个转染24 h的细胞重悬于无血清的培养基中，取细胞混合液贴壁置于小室的上层，取含有20%的FBS的培养基加入至小室的下层，在浓度为5%、温度为37℃的CO2条件中培养18 h，取出小室，去除培养基，擦去上层细胞，取PBS进行冲洗，用甲醇进行5 min固定，取结晶紫染色15 min，取清水浸洗，晾干后封片，于100倍镜下抽取5个视野进行计数。所有试验均重复3次。

1.2.6 RL95-2细胞迁移能力检测:用含有10%FBS的DMEM培养液将非转染组、转染组、对照组细胞以5×105/ml的密度接种于6孔板中, 待细胞生长至80%左右，将培养液换为无血清的DMEM 24 h，用200 μl 的枪头在单层细胞上划痕, 用PBS洗1遍, 加无血清培养液中24 h，用倒置显微镜于40倍镜下观察24 h后细胞由划痕边缘向划痕内迁移的细胞数。所有试验均重复3次。

1.2.7 RL95-2细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)检测:通过Westernblotting法对RL95-2细胞MMP-2表达情况进行测定。所有试验均重复3次。

1.3 观察指标 (1)比较子宫内膜癌与癌旁组织miR-15a相对表达量；(2)比较子宫内膜癌不同临床病理指标患者miR-15a相对表达量；(3)比较不同组别的miR-15a和MMP-2相对表达量；(4)比较不同组别的细胞侵袭力和迁移力。

2 结果

2.1 子宫内膜癌与癌旁组织miR-15a相对表达量比较 子宫内膜癌组织miR-15a相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 子宫内膜癌与癌旁组织miR-15a相对表达量比较 ±s

2.2 不同临床病理指标患者miR-15a相对表达量比较miR-15a相对表达量与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润程度、分化程度相关(P<0.05)，与年龄、病理类型无关(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理指标患者miR-15a相对表达量比较 ±s

2.3 不同组别miR-15a和MMP-2相对表达量比较 转染组miR-15a相对表达量明显高于未转染组和对照组，MMP-2相对表达量明显低于未转染组和对照组(P<0.05)；未转染组、对照组的miR-15a和MMP-2相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别miR-15aMMP-2转染组 8.72±2.631.65±0.61未转染组3.58±1.84*4.65±2.18*对照组 3.64±1.98*4.59±2.02*

注: 与转染组比较，*P<0.05

2.4 不同组别细胞侵袭力与迁移力比较 转染组侵袭力与迁移力均明显低于未转染组和对照组(P<0.05);未转染组、对照组的细胞侵袭力与迁移力比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图1、2。

表4 不同组别细胞侵袭力与迁移力比较 n=3,个±s

注: 与转染组比较，*P<0.05

3 讨论

目前，在子宫内膜癌患者中以药物联合手术的综合治疗方案取得了显著效果，尤其是一些早期患者的预后得到明显改善。不过临床显示，17%～51%的子宫内膜癌患者会发生远处转移，6%～21%出现局部复发，而复发转移是导致子宫内膜癌患者死亡的主要因素[7]。因此，积极探寻反映子宫内膜癌患者病理过程的相关分子标志物，对降低病死率具有重要意义。肿瘤细胞转移、侵袭、浸润是恶性肿瘤最本质的表现和重要标志，也是导致患者预后较差的主要因素；肿瘤细胞转移、侵袭、浸润也是一个多步骤、连续性的生物学过程，这需要多种生长因子、细胞因子等共同作用完成，对恶性肿瘤细胞转移、侵袭、浸润等机制开展相关研究，有助于为患者生物治疗提供一个作用靶位[8]。miR-15a位于人染色体的13q14处，属于miRNA的一个重要类型。既往研究证实，miR-15a为抑癌基因的一种，在大多数恶性肿瘤当中不表达或者低表达[9]。

对照组未转染组转染组

图1 3组细胞侵袭力比较(结晶紫染色×100)

对照组未转染组转染组

图2 3组细胞迁移力比较(×40)

在本研究中，子宫内膜癌组织中miR-15a的相对表达量要明显低于癌旁组织。研究结果提示，在子宫内膜癌患者中miR-15a呈低表达。进一步分析不同临床病理指标患者miR-15a相对表达量发现，miR-15a相对表达量与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润程度、分化程度相关，随着患者临床分期、肌层浸润程度、分化程度的增加以及出现淋巴结转移，miR-15a相对表达量逐渐降低，表明miR-15a与子宫内膜癌患者的转移、浸润有一定关系，当miR-15a呈低表达时，可促进癌细胞的转移或者浸润。这与临床相关研究结果[10,11]相近。为进一步分析在子宫内膜癌中miR-15a与癌细胞转和侵袭的关系，本研究中通过体外细胞试验的方法，对RL95-2细胞转染不同的miR-15a模拟片段，采取Transwell肿瘤细胞侵袭试验和Transwell肿瘤细胞迁移试验对miR-15a不同表达细胞侵袭力、迁移力分别进行了测试。研究结果显示，在转染组中代表侵袭力、迁移力的穿膜细胞数计数均明显高于未转染组、对照组，表明miR-15a和子宫内膜癌细胞侵袭力、迁移力密切相关，高表达的miR-15a可能起到了抑制癌细胞侵袭、转移的作用。

MMP-2为基质金属蛋白酶家族的重要组成部分，当机体出现病理改变后MMP-9被相关因子激活，表达显著上调，使得细胞外基质被大量降解，大大削弱了斑块纤维帽，从而促进了冠状动脉粥样硬化的发生与发展；同时，MMP-2能够促使骨胶原出现降解，有助于加快瘤细胞的转移或者侵袭、扩散等[12]。临床相关研究指出，MMP-2在子宫内膜癌患者中呈高表达，而且与患者的组织浸润、淋巴结转移相关[13]。本研究结合MMP-2对过表达的miR-15a促进癌细胞转移、侵袭的作用机制进行了分析，研究结果显示，转染组中MMP-2相对表达量要明显低于未转染组和对照组，提示miR-15a处于高表达时可能是通过对MMP-2表达进行抑制，从而发挥抑制子宫内膜癌细胞转移、侵袭的作用。

综上所述，在子宫内膜癌患者中miR-15a以低表达为主，且与淋巴结转移、分化程度、肌层浸润程度、FIGO分期有关，miR-15a作为抑癌基因可能是通过抑制MMP-2蛋白发挥抑制癌细胞转移及侵袭的作用。

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Expression and clinical significance of miR-15a in endometrial carcinoma

SHAOTian.

GeneralHospitalofShandongProvincialYankuangGroup,ShandongZoucheng273500,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-15a in endometrial carcinoma tissues in order to explore the possible action mechanism of miR-15a in the pathogenesis and development of endometrial carcinoma.Methods The expression levels of of miR-15a were detected by fluorescence quantitative PCR in 68 cases of endometrial carcinoma tissues and 68 cases of adjacent tissues of tumor. The independent sequence analog (non-transfection group),miR-15a analog (transfection group) was transfected into RL95-2 endometrial cancer cells,respectively, moreover, an negative control group was established (control group). The expression levels of miR-15a and matrix metalloproteinase2 (MMP-2) were detected and compared among the three groups. Besides the invasion ability and migration ability of RL95-2 cells were detected by Transwell tumor cell invasion assay and Transwell tumor cell migration assay.Results The relative expression levels of miR-15a in endometrial carcinoma tissues were significantly lower than those in adjacent tissues of tumor (P<0.05). The relative expression levels of miR-15a were correlated to FIGO staging,lymph node metastasis, muscular layer infiltration degree and differentiation degree of endometrial carcinoma (P<0.05).TherelativeexpressionlevelsofmiR-15aintransfectiongroupweresignificantlyhigherthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup,howevertherelativeexpressionlevelsofMMP-2intransfectiongroupweresignificantlylowerthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup(P<0.05).BesidestheinvasionabilityandmigrationabilityofRL95-2cellsintransfectiongroupweresignificantlylowerthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup(P<0.05).Conclusion The expression levels of miR-15a in patients with endometrial carcinoma are lower,moreover,which are correlated with lymph node metastasis,differentiation degree,myometrial invasion degree,FIGO staging. As a tumor suppressor gene, miR-15a may play an inhibitory role in the metastasis and invasion of cancer cells by inhibiting the expression of MMP-2 protein.

endometrial carcinoma；miR-15a；expression levels；metastasis and invasion；analysis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.003

273500 山东省邹城市，山东省兖矿集团总医院

R

A

1002-7386(2017)08-1133-04

2016-10-19)