黄皮叶超声提取物的抑菌性能研究

贾桂云，关红旗，韩玉兰，刘 红，2*

（1.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；2.海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571127）

黄皮叶超声提取物的抑菌性能研究

贾桂云1，关红旗1，韩玉兰1，刘 红1，2*

（1.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；2.海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571127）

利用超声回流法获取不同溶剂（水、乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、环己烷）的黄皮叶提取物，选用滤纸片扩散法进行抑菌试验、二倍稀释法测定最小抑菌浓度，研究黄皮叶提取物对十种微生物的抑制作用.结果表明：乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮提取物对供试的细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、四联微球菌、蜡状芽孢杆菌）有明显抑菌效果.乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、白色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.2 mg/mL；对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为6.3 mg/mL；对四联微球菌的最小抑菌浓度是12.5 mg/mL.乙酸乙酯提取物抑菌性受温度、pH影响较大，受光照影响不明显.各种溶剂的超声提取物对供试真菌（黑曲霉、青霉、根霉、白色念珠菌）均无抑菌效果.该研究结果为开发利用黄皮叶的防腐、抑菌作用提供参考.

黄皮叶；超声提取；抑菌性能；最小抑菌浓度

黄皮叶是芸香科黄皮属植物黄皮[Clausena lansium（lour.）Skeels]的叶子.黄皮在我国福建、广东、广西、海南等地区有广泛种植，其果实含有大量的糖分、有机酸、丰富的Vc、挥发油及黄酮等成分，是食用营养价值较高的岭南佳果，并且黄皮树根、树叶、果实及种子有较高的药用价值.黄皮叶味苦、辛、平，有疏风解表、化痰顺气、行气止痛及利尿消肿的功效，主要用于治疗流行性感冒、流行性脑脊髓膜炎、疟疾等.民间多用其煮水洗浴治疗疥癫、消风肿等[1-4].黄皮叶含有卡巴唑、黄皮酰胺生物碱类、香豆素、挥发油及萜类等化合物，其中，黄皮酰胺能改善记忆障碍、抗衰老、解毒保肝、益智，具有抗老年痴呆的作用[4-5].

为研究黄皮叶的抑菌作用，采用不同溶剂超声回流提取黄皮叶，研究提取物对10种常见细菌、真菌的抑制性能.

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器与设备

VS-1300医用净化工作台（吴江市伟峰净化设备有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DRP-9052型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；XO-5200DTS型超声清洗仪（南京先欧仪器制造有限公司）；RE-52AA旋蒸仪（上海亚荣生化仪器厂）.

1.2 试剂

营养肉汤、琼脂粉（广东环凯微生物科技有限公司）；改良马丁培养基（北京三药科技开发公司）；乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、环己烷等均为分析纯；蒸馏水自制.

1.3 供试材料与菌种

黄皮叶采自海口桂林洋大学城.洗净、阴干、低温烘干、粉碎.即为供试样品.

实验用菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、四联微球菌（Quad micrococcus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cere⁃us）、黑曲霉（Aspergillus nigar）、青霉（Penicillium）、根霉（Rhizopus stolonifer）、白色念珠菌（Candida albicans）等由海南师范大学生命科学学院微生物学实验室提供.

2 实验方法

2.1 黄皮叶超声提取物的制备

称取10.0 g黄皮叶粉末共5份.按料液比1：15（g/mL)分别加入蒸馏水、乙酸乙酯、无水乙醇、环己烷、丙酮，在温度60℃、功率比90%条件下，超声回流提取30 min.提取液减压浓缩后转入100 mL容量瓶中，用相应的溶剂定容，得到浓度为100 mg/mL（相当于生药）的5种提取物.

2.2 培养基的制备

细菌培养基配方：营养肉汤18 g、琼脂粉15 g.溶化后补蒸馏水至1000 mL.真菌培养基配方：改良马丁培养基28 g、琼脂粉15 g.溶化后补蒸馏水至1000 mL[6].

培养基在0.1MPa、121℃条件压力蒸汽灭菌器中灭菌40 min，备用.

2.3 菌悬液的制备

在超净工作台上，用划线法将存放在4℃冰箱中的供试菌接种在斜面培养基上.细菌37℃培养24 h，真菌28℃培养48 h.活化菌种.

用已灭菌的接种环挑取少量活化好的菌体移至盛有10 mL无菌水的试管中.振荡摇匀.制成菌原液，然后用无菌水梯度稀释，得到不同稀释度的菌悬液.用0.20 mL移液管吸取各稀释度的菌悬液，均匀涂布在培养基表面，恒温培养，选择培养基表面均匀长满菌的对应菌液浓度作为供试菌悬液[7].

2.4 抑菌性能测定

抑菌性能实验采用纸片扩散法[6-7].

将无菌滤纸片（d＝13.00 mm）浸泡在黄皮叶的提取物中，空白试验则用无菌滤纸片浸泡在相应的提取溶剂中，浸泡时间30 min，沥干，作为药敏滤纸片备用.

将已灭菌的新鲜培养基约30 mL倒入无菌培养皿中，自然冷却、凝固后，用无菌移液器滴加供试的菌悬液200 μL，均匀涂布，用无菌镊子将药敏滤纸片贴在含菌培养基表面，每种溶剂提取物做3次平行试验.细菌37℃培养24 h.霉菌28℃培养48 h.用游标卡尺采用十字交叉法测抑菌圈的直径，计算平均值.

2.5 乙酸乙酯提取物最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用2倍稀释法，用对应的提取溶剂将浓度100 mg/mL的黄皮叶超声回流提取物稀释成浓度分别为50、25、12.5、6.3和3.2 mg/mL，测定它们的抑菌效果.分别吸取系列浓度的供试样品2 mL，注入装有18 mL未凝固培养基的无菌培养皿中，混合均匀，培养基凝固后，得到系列浓度的提取物供试平板.用移液器吸取0.2 mL供试的细菌悬液注入平板表面，均匀涂布，放入培养箱中37℃培养24 h.每个浓度做了3次平行试验，以不长菌的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）.

2.6 温度、光照和PH值对黄皮叶超声乙酸乙酯提取物抑菌稳定性的测定

2.6.1 温度对乙酸乙酯提取物抑菌效果的影响

提取物分别置于0℃、23℃、40℃、60℃、80℃、100℃的恒温水浴槽中30 min取出，按2.4节测定抑菌效果.

2.6.2 光照对提取物抑菌效果的影响

提取物置于6个具塞试管中，其中1个试管放在暗处，5个试管用白炽灯照射，分别于2、4、8、16、24 h后按2.4节测定抑菌效果.

2.6.3 pH值对提取物抑菌效果的影响

用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节培养基的pH分别为4、5、6、7、8、9.分别按2.4节测定抑菌效果[8].

3 结果与分析

3.1 黄皮叶不同溶剂的提取物抑菌效果

不同溶剂超声提取物抑菌效果见表1.

表1 黄皮叶的5种溶剂提取物抑菌效果Tab.1 Antimicrobial effects of the extracts by five solvents

结果显示，乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、四联微球菌、蜡状芽孢杆菌具有很强的抑菌效果，水、环己烷提取物抑菌效果不明显.所有溶剂的提取物对黑曲霉、青霉、根霉、白色念珠菌均无抑菌效果.

3.2 黄皮叶乙酸乙酯超声提取物的浓度对抑菌效果影响

不同浓度的黄皮叶乙酸乙酯提取物对供试菌的抑菌效果及强度见表2.

从表2可见，黄皮叶乙酸乙酯超声提取物浓度与抑菌效果正相关，浓度为50 mg/mL时，对金色葡萄球菌、大肠杆菌、四联微球菌、蜡状芽孢杆菌仍有较强的抑制作用，3.2 mg/mL的浓度对大肠杆菌、白葡萄球菌仍有抑菌效果.黄皮叶乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、白色葡萄球菌MIC均为3.2 mg/mL；对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌MIC为6.3 mg/mL；对四联微球菌MIC是12.5 mg/mL.

表2 不同浓度黄皮叶乙酸乙酯提取物的抑菌效果Tab.2 Antimicrobial effects of different concentration extract by ethyl acetate

3.3 温度、光照和pH对乙酸乙酯提取物抑菌稳定性的影响

环境温度、光照和pH对乙酸乙酯提取物抑菌作用的影响见表3、4、5.由表3可知，乙酸乙酯提取物在低于40℃的环境条件下，对大肠杆菌、四联微球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌性能随着环境温度的升高而增大，环境温度高于60℃，其抑菌效果明显减小.不同环境温度下，乙酸乙酯提取物对白色葡萄球菌抑菌性能影响不明显.表4反映出24 h内乙酸乙酯提取物的抑菌效果不随光照时间的变化而发生显著变化，表明提取物中的抑菌成分不受光照时间影响.表5说明提取物在酸性条件下，抑菌性能随着pH发生变化，pH=6～8时，对所有供试菌抑菌效果最强；而pH＞8，抑菌性能降低.

表3 不同温度对乙酸乙酯提取物抑菌效果的影响Tab.3 Antimicrobial effects of acetic ether extract in different temperature

4 结论

黄皮叶用不同溶剂超声波辅助进行提取.采用二倍稀释法对提取物进行抑菌活性及稳定性研究.结果表明：乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮提取物对金黄色葡萄球、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、四联微球菌、蜡状芽孢杆菌有明显的抑菌效果.乙酸乙酯提取物抑菌效果与提取物的浓度正相关；黄皮叶水提取物、环己烷提取物对上述菌种抑菌效果不显著.乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、白色葡萄球菌最小抑菌浓度为3.2 mg/mL，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的最小抑菌浓度为6.3 mg/mL，对四联微球菌的最小抑菌浓度为12.5 mg/mL.黄皮叶各种溶剂的提取物对黑曲霉、青霉、根霉、白色念珠菌均无抑菌效果.乙酸乙酯提取物抑菌稳定性实验显示，光照时间24 h内对提取物的抑菌效果没有影响；温度0～40℃，pH 6～8条件下提取物抑菌效果较强.

我国南方黄皮叶资源丰富，开发利用黄皮叶的抑菌性能在医疗领域和替代化学防腐剂用于食品保鲜领域都有着广阔的应用前景.黄皮叶抑菌有效成分的分离、鉴定等有待于进一步的研究.

表4 不同光照时间对乙酸乙酯提取物抑菌性能的影响Tab.4 Antimicrobial effects of acetic ether exact during different light time

表5 不同pH对乙酸乙酯提取物抑菌效果的影响Tab.5 Antimicrobial effects of extract in different pH value

[1]陈广全.黄皮高产优质栽培技术[J].中国热带农业，2006（1）：44-46.

[2]《全国中草药编》编写组.全国中草药汇编(上册)(第二版)[M].北京：人民卫生出版社，1996.

[3]赵丰丽，杨健秀，梁燕美，等.黄皮叶乙醇提取物化学成分预实验及对植物病原菌的抑制作用[J].食品科技，2009，34（1）：195-199.

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[5]杨明河，曹延怀，李伟勋，等.黄皮叶中黄皮酰胺的分离和结构测定[J].化学学报，1987，22（1）：33-40.

[6]管远志，王艾琳，李坚，等.医学微生物学实验技术[M].北京：化学工业出版社，2006.

[7]贾桂云，邹润英，郭飞燕.竹叶提取物抑菌效果研究[J].海南师范大学学报（自然科学版），2010，23（4）：420-422.

[8]陈佳佳，刘凡，廖森泰，等.桑叶提取物抑菌活性及抑菌稳定性的研究[J].食品科技，2012，33（9）：88-91.

责任编辑：杨国峰

Study on the Antimicrobial Effects on Extract ofClausena lansiumLeaves by Ultrasound

JIA Guiyun1，GUAN Hongqi1，HAN Yulan1，LIU Hong1，2＊
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China；2.Key Laboratory of Research and Development on Topical and Special Medicine and Edible Plant，Haikou571127，China）

The effective components fromClausena lansiumleaves were extracted using the ultrasound reflux.The antimi⁃crobial effects of different solvents（water、ethyl acetate、anhydrous ethanol、acetone、cyclohexane）extracts were observed through disk diffusion method,and minimum antibacterial concentrations experiments by double dilution method.The anti⁃microbial effects for 10 kinds of microbes by extracts ofClausena lansiumleaves were studied.The results showed that the extract respectively extracted by ethyl acetate,ethanol and acetone had evidently antibacterial effect on testing bacteria（Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Bacillus subtilis,Staphylococcus albus,Quad micrococcus and Bacillus cereus）. The minimum inhibitory concentration（MIC）of ethyl acetate extract onEscherichia coliandStaphylococcusalbus were on 3.2 mg/mL,onStaphylococcus aureus Bacillus cereusandBacillus subtiliswere 6.3 mg/mL,on Quad micrococcus 12.5 mg/ mL.The temperature,pH value of ethyl acetate extract had great influence on antimicrobial effects,while lighting effect was not obvious.But all solvents extraction had no obvious antibacterial effect on testing fungi（Aspergillus nigar,Penicilli⁃um,Rhizopus stolonifer,Candida albicans）.

Clausena lansiumleaves；ultrasonic extract；antimicrobial effects；MIC

R 285

A

1674-4942（2017）01-0019-05

2016-11-17

海口市应用技术研究与开发项目（2016013）；海南省社会发展专项(2015SF11)

*通讯作者：刘红，教授，E-mail：lhyd123@126.com

10.12051/j.issn.1674-4942.2017.01.004