基于石墨烯-TiO2复合材料的蛋白质电化学传感器的研究

谢 慧，闫丽君，张国平，董瑞霞，何博琳，王子匀，荣翠林，刘 炜，孙 伟

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

基于石墨烯-TiO2复合材料的蛋白质电化学传感器的研究

谢 慧，闫丽君，张国平，董瑞霞，何博琳，王子匀，荣翠林，刘 炜，孙 伟*

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

采用层层涂布法把石墨烯-二氧化钛（GR-TiO2）复合材料、血红蛋白（Hb）和Nafion滴涂在固体电极表面制备出相应的蛋白质电化学传感器.为了证明Hb与复合材料混合后其原始构象基本不变，采用光谱技术进行表征.利用循环伏安扫描在Hb修饰电极上出现一对良好对称峰形的准可逆氧化还原峰，表明电活性的Hb发生反应.同时利用此方法求解了电化学参数如电子传递系数和异相电极反应速率常数，考察了该电化学传感器对三氯乙酸的电催化行为.

血红蛋白；离子液体；石墨烯-二氧化钛复合材料；电化学传感器

离子液体是一种具有特殊性能的有机化合物，其结构完全由离子组成，表现出很高的离子导电性.同时它具有较宽的电化学窗口范围、较好的稳定性、良好的生物相容性、不易挥发、溶解性好等优良性质，在电化学分析中得到了广泛的应用[1].

石墨烯（GR）是由单层的碳原子紧密堆积成的二维纳米片，具有电导率高和比表面积大等优点，在电化学和电化学分析方面均有综述报道[2].石墨烯纳米片是良好的平面载体，可以负载其它多种材料从而构建复合材料，发挥各组分之间协同作用[3].二氧化钛（TiO2）微粒具有良好的生物相容性、较高的热稳定性和化学稳定性、高比表面积、易分散、易烧结和低熔点等独特性能，在材料化学和电化学中应用广泛[4-5].近年来已有多种合成GR-TiO2复合材料的方法报道并且被广泛应用在生物传感器、超级电容器、光电化学等不同领域[6-9].

本文以离子液体修饰碳糊电极为基底电极（CILE），利用层层涂布法将GR-TiO2复合材料、Hb和Nafion滴涂固定在基底电极表面制得修饰电极（Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE）.此蛋白质修饰电极综合了离子液体和GR-TiO2的优点，形成一个比表面积大和导电性好的传感界面，血红蛋白（Hb）在该界面上能得到良好的固定并且保持其原有的二级结构与生物活性.该修饰电极界面表现出较大的比表面积和较高的导电性，有利于Hb的固定和电子转移反应的进行，所制备的蛋白质电化学传感器对三氯乙酸（TCA）表现出较好的电催化还原效应.

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

1.1.1 试剂

Hb（MW64500，美国Sigma公司）；离子液体（HPPF6，兰州雨陆精细化工公司）；光谱纯石墨粉（上海胶体化工有限公司）；石墨烯-二氧化钛纳米复合材料（GR-TiO2）由实验室合成；TCA（天津科密欧化学试剂公司）；Nafion（0.5%乙醇溶液）；0.1 mol/L磷酸盐系列缓冲溶液（PBS）为支持电解质.实验所需仪器及厂家如表1所示.

1.1.2 仪器

电化学分析仪（CHI 660D型，上海辰华仪器公司），三电极体系：工作电极为Nafion/HRP/Pd-GR/CILE，参比电极为饱和甘汞电极（SCE），辅助电极为铂电极；扫描电子显微镜（SEM，JSM-7100F型，日本电子公司）；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet6700，美国赛默飞世尔科技公司）；双光束紫外可见分光光度计（TU-1901型，北京普析通用仪器责任有限公司）.

1.2 电极的制备

按照文献[10]制备CILE，以CILE为基底电极，采用滴涂法将6 μL 0.5 mg/mL的GR-TiO2分散液均匀涂布在CILE表面，室温晾干后继续滴涂6 μL 15.0 mg/mL Hb水溶液，晾干后滴涂8 μL Nafion溶液，自然晾干后即制得所需的工作电极.

1.3 实验方法

利用紫外-可见吸收光谱和傅立叶变换红外光谱检测蛋白质是否变性.用循环伏安扫描考察Hb的直接电化学行为.在测试前需利用通N2除氧30 min来除去支持电解质中的溶解氧，并在测试中保持N2气.

2 结果与讨论

2.1 光谱图分析

图1 （A）Hb在水中（a）和GR-TiO2混合液（b）中的紫外可见光谱图;（B）（a）Hb和（b）Hb-GR-TiO2复合材料的红外光谱图Fig.1(A)UV-Vis spectra of(a)Hb and(b)Hb-GR-TiO2mixture;(B)FT-IR spectra of(a)Hb and(b)Hb-GR-TiO2

紫外可见吸收光谱法是研究蛋白质构象变化的常用手段，Hb的结构变化可以观察Fe(Ⅲ)的Soret吸收带的变化[11].Hb在水和GR-TiO2混合液中的紫外可见吸收结果如图1A所示.Hb水溶液的最大吸收波长为414 nm（曲线a），与在GR-TiO2混合液中的吸收波长410 nm（曲线b）基本相同，表明Hb在GR-TiO2混合液中仍能良好地保持其原始构象.

红外光谱也常用于研究蛋白质的结构，因为肽链骨架的C=O伸缩振动与蛋白质结构中的酰胺I（1700～ 1600 cm-1）有关，N-H弯曲振动和C-N伸缩振动与蛋白质结构中的酰胺Ⅱ（1620～1500 cm-1）有关，酰胺Ⅰ和Ⅱ特征吸收峰可以反映多肽链二级结构的变化[12].Hb及其与GR-TiO2复合材料的红外吸收结果如图1 B所示.在GR-TiO2中Hb的特征吸收峰分别位于1645.05 cm-1和1547.54 cm-1（曲线b），与Hb的特征吸收峰1643.32 cm-1和1542.20 cm-1（曲线a）非常接近，可以认为Hb基本保持了其天然构象而没有发生变性.

2.2 电化学交流阻抗谱图分析

图2为不同修饰电极（a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Nafion/CILE，（c）CILE和（d）Nafion/Hb/CILE的交流阻抗图.CILE（曲线c）的阻抗值为70.15 Ω，而Nafion/CILE（曲线b）的阻抗值为119.66 Ω，这是由于不导电的Nafion膜阻碍了铁氰化钾向电极表面的扩散.Nafion/Hb/CILE（曲线d）的阻抗值增大到251.28 Ω，这是由于Hb分子进一步阻碍了电子转移.而Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE（曲线a）的阻抗值降低为23.92 Ω，这是由于GRTiO2复合材料具有高导电性和大表面积，加快了电子转移，有效地减小电子传递电阻.

2.3 Hb的直接电化学行为

通过循环伏安法研究了在0.1 mol/L pH 3.0 PBS中Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE的电化学行为，结果见图3（a）.可以发现一对峰形对称且准可逆的氧化还原峰，为典型的血红素蛋白质特征峰，其还原峰电位（Epc）为-0.237 V（vs.SCE），氧化峰电位（Epa）为-0.166 V（vs.SCE），峰电位差（△Ep）为71 mV.根据公式Eo′=（Epc+Epa）/2，可得Hb的式电位（Eo′）为-0.202 V（vs.SCE），氧化还原峰电流之比接近于1.而在Nafion/ GR-TiO2/CILE（曲线b）和CILE（曲线c）上均无氧化还原峰，说明这对峰是Hb电化学反应产生的，GR-TiO2复合材料的独特物理化学性质可以为Hb提供一个很好的微环境，有利于电化学活性中心的电子转移，加快了反应速率.

图2 不同修饰电极（a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Na⁃fion/CILE，（c）CILE，（d）Nafion/Hb/CILE的交流阻抗图Fig.2 EIS for Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE(a),Nafion/ CILE(b),CILE(c),Nafion/Hb/CILE(d)Nafion/Hb/CILE

图3 （a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Nafion/GR-TiO2/CILE和（c）CILE在pH 3.0的PBS中的循环伏安图，扫速为0.1 V/sFig.3 Cyclic voltammograms of(a)Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE,(b)Nafion/GR-TiO2/CILE and(c)CILE in pH 3.0 PBS with scan rate as 0.1 V/s

2.4 扫速的影响

图4A展示了不同扫速对Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE电化学响应的影响.循环伏安扫描表明在100～700 mV/s扫速范围内均出现一对准可逆氧化还原峰，峰电流随扫速的增加而增大，阳极峰电位和阴极峰电位分别发生正移和负移，式电位(Eo′)相对稳定.由准可逆薄层电化学过程的Laviron理论[13-14]可以计算导出Ep与ln ν的关系，结果如图4 B所示，根据公式可计算求得电子转移数（n）和异相电极反应电子转移系数（α）分别为1.04和0.55，进一步求得电极反应速率常数（ks）为2.03 s-1，ks值比一些文献值要高，如GR/Fe3O4/Hb/GCE（0.3 s-1）[15]，Hb-IL-MWCNT-CPE（0.84 s-1）[16]，C60-MWCNT/GCE（0.39 s-1）[17]等，说明GR-TiO2复合材料可以加快Hb的反应速率.

图4C展示了峰电流（Ip）与扫描速度的关系，其与扫速（ν）呈线性关系，表现出薄层电化学行为.线性回归方程分别为Ipc（μA）=103.14 ν（V/s）+19.98（n=13，γ=0.998）和Ipa（μA）=-92.28 ν（V/s）–11.2（n=13，γ=-0.998）.由方程Q=n A F г*[18]可计算求得电活性的Hb在电极表面覆盖度（г*）为1.35×10-9mol/cm2，为Hb总浓度（1.11×10-8mol/cm2）的12.27%.

图4 （A）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE不同扫速下的循环伏安图（由m到a分别为700，650，600，550，500，450，400，350，300，250，200，150，100 mV/s）；（B）峰电位（Ep）与扫描速度的对数（ln ν）之间的关系；（C）为氧化峰电流（Ipa）和还原峰电流（Ipc）与扫速（ν）的关系曲线Fig.4 (A)Influence of scan rate on electrochemical responses of Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE with scan rates from m to a as 700,650,600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,100 mV/s,respectively;(B)Linear relationship of the re⁃dox peak potentials versus ln ν;(C)Linear relationship of the redox peak currents versus scan rate(ν)

2.5 pH的影响

图5展示了不同酸碱度PBS对Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE电化学行为的影响.Hb的氧化还原峰电位均随着pH值的增大而发生负移，这是典型的准可逆过程，两者之间可得一个良好的线性关系，线性方程为Eo′（mV）=-56.83 pH-48.39（γ=0.988）.式电位随着pH的增大而增加且斜率为-56.83 mV/pH，稍小于25°C条件下可逆体系中的理论值（-59.0 mV/pH），因此Hb在修饰电极上发生单电子和单质子的反应，方程为Hb Fe (Ⅲ)+H++e→Hb Fe(Ⅱ).

2.6 Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE对TCA的电化学催化

图6展示了Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE对TCA的电化学催化还原行为.在0.1 mol/L pH 3.0 PBS中加入不同浓度的TCA后循环伏安扫描，氧化峰电流逐渐减小甚至消失，而还原峰电流在-0.288 V处明显增大，这是典型的电催化TCA反应现象，说明固定在Nafion/GR-TiO2膜内的Hb保持催化活性，能够有效地将TCA催化还原.当TCA浓度在0.5～35.0 mmol/L范围内还原峰电流与TCA浓度之间的线性回归方程为Ip（μA）=2.49 C（mmol/L）+65.98（n=11，γ=0.965），检测限为0.207 mmol/L（3 σ）.

2.7 稳定性与重现性

将该修饰电极放置在4℃冰箱中保存两周后取出，对其进行循环伏安表征，发现峰电流值几乎不变，这表明Hb在Nafion/GR-TiO2复合膜内能稳定地保持生物活性和原始构型.为了说明制备修饰电极具有良好的重现性，平行制备四根电极对20.0 mmol/L TCA进行检测，计算求得相对标准偏差为2.2%.

3 结论

图5 不同pH缓冲溶液中Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE的循环伏安图（a到e分别为3.0、2.0、4.0、5.0、6.0）Fig.5 Cyclic voltammograms of Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE in different pH PBS(from a to e as 3.0,2.0,4.0, 5.0,6.0)

图6 Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE在不同浓度TCA下的循环伏安图（a到k TCA浓度分别为0，0.5，1.0，2.5，5.0，11.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0 mmol/L）Fig.6 Cyclic voltammograms of Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE with 0,0.5,1.0,2.5,5.0,11.0,15.0,20.0,25.0, 30.0,35.0 mmol/L TCA(curve a to k)

运用光谱法和电化学法对Nafion/GR-TiO2复合膜内固定的Hb的结构与性能进行研究.红外与紫外可见吸收光谱结果表明Hb在Nafion/GR-TiO2膜内没有发生变性，保持了原始构型.电化学实验结果表明GRTiO2的存在极大增加了Hb电活性中心与电极之间的电子转移，循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰，说明实现了直接电子转移，Nafion/GR-TiO2膜中的Hb对TCA表现出良好的电催化行为.

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责任编辑：刘 红

Electrochemical Protein Sensor Based on Graphene-TiO2Nanocomposite Modified Electrode

XIE Hui，YAN Lijun，ZHANG Guoping，DONG Ruixia，HE Bolin，
WANG Ziyun，RONG Cuilin，LIU Wei，SUN Wei＊
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

In this paper ionic liquid modified carbon paste electrode is used as the basal electrode（CILE）,which is coat⁃ed with GR-TiO2nanocomposite,hemoglobin（Hb）and Nafion to get an electrochemical protein sensor（Nafion/Hb/GRTiO2/CILE）.Spectroscopic results indicate that Hb almost keeps the original characteristics without denaturation.Cyclic voltammetry is used and on Hb modified electrode a pair of quasi-reversible redox peaks appear,which indicates that Hb is electroactive.Electrochemical parameters such as electron transfer number and heterogenous electron transfer coefficient are calculated.And this electrochemical sensor is applied to the electrocatalytic reduction of trichloroacetic acid.

hemoglobin；ionic liquid；graphene-TiO2nanocomposites；electrochemical sensor

O 646；Q 51

A

1674-4942（2017）01-0028-06

2016-11-17

海南省自然科学基金（20162031）；海南师范大学校级大学生创新创业训练计划项目（cxcyxj2015009）

*通讯作者：孙伟，教授，E-mail：swyy26@hotmail.com

10.12051/j.issn.1674-4942.2017.01.006