体外受精-胚胎移植反复种植失败与抗磷脂抗体的相关性研究

唐 君，毛增辉，刘人杰，黄 启，文 壹

（湖南省计划生育研究所生殖医学中心，湖南 长沙 410000）

体外受精-胚胎移植反复种植失败与抗磷脂抗体的相关性研究

唐 君，毛增辉，刘人杰，黄 启，文 壹

（湖南省计划生育研究所生殖医学中心，湖南 长沙 410000）

目的 研究抗磷脂抗体（APA）与体外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎反复种植失败（RIF）的相关性。方法 选取本生殖中心2013年3月～2015年7月IVF-ET后RIF者100例为研究对象，作为研究组，同期第一次接受体外受精-胚胎移植妊娠者100例为对照组，研究组纳入之前，接受≧5个同期胚胎移植。采用APA金标法定性及ELISA定量法检测IgG、IgM抗心磷脂抗体、抗磷脂酰乙醇胺抗体、抗磷脂酰肌醇抗体、抗磷脂酰酸抗体、抗磷脂酰甘油抗体、抗磷脂酰胆碱抗体和抗磷脂酰丝氨酸抗体。结果 （1）研究组IVF-ET反复种植失败者中有23例检测到阳性特异性抗磷脂抗体，阳性率为23%；对照组中仅有4例检测到阳性特异性抗磷脂抗体，阳性率4%，研究组阳性率显著高于对照组。（2）研究组IVF-ET反复种植失败者7种特异性抗磷脂抗体IgG、IgM定量检测平均值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 IVF-ET反复种植失败者7种特异性抗磷脂抗体IgG、IgM定性检测阳性率及定量检测平均值均显著高于同期第一次接受体外受精-胚胎移植妊娠者，抗磷脂抗体与IVF-ET后RIF呈正相关，提示抗磷脂抗体可能是导致反复着床失败的原因之一。

抗磷脂抗体；体外受精-胚胎移植；反复种植失败

人类辅助生殖技术应用以来，为广大不孕夫妇带来了福音，而其高效的培养 系统、良好的胚胎选择方法和手段以及完善的胚胎移植技术使得目前的体外受精胚胎移植妊娠率已经达到甚至超过了自然妊娠[1]，试管婴儿在世界各地不断诞生，但仍然存在不可忽视的RIF现象，给患者带来了经济和精神上的打击，那么其发生机制的研究和如何改变这类患者的治疗结局来提高种植成功率，成为了生殖生物学和辅助生殖技术领域研究的难点与热点。自1985年国外Gleicher[2]等人定义了抗磷脂抗体与复发性流产以及不明原因不孕症和子宫内膜异位症的关系以来，APA被广泛用于描述与复发性流产的相关性。早期有国外研究报道认为复发性流产、不明原因不孕症和子宫内膜异位症女性受试者中存在抗磷脂抗体，则诊断有生殖免疫衰竭综合征（RAFS）[3]。虽然我国医学上目前对于RIF的病因尚不明确，但普遍认为其可能与配子和胚胎、子宫内膜以及自身免疫调节机制相关。遗憾的是目前国内尚无APA与IVF-ET后的胚胎反复种植失败的研究报道。本研究采用APA定性和定量对100例IVF-ET反复种植失败者血清中7种特异性抗磷脂抗体进行检测，并将此结果与100例同期第一次接受体外受精-胚胎移植妊娠者进行了比较，全面分析APA与RIF的相关性，同时也为RIF患者是否需要药物干预及治疗后再次助孕妊娠结局分析提供可行性依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本生殖中心2013年3月～2015年7月IVF-ET后RIF者100例为研究对象，RIF定义为移植5个或以上胚胎无着床迹象。纳入标准：胚胎移植周期数≥ 2周期，移植胚胎总数≥5个，移植后第12天β-HCG＜3 mIU/mL；排除男女方染色体、病毒感染、自然流产史及子宫内膜因素。另选100例同期第一次IVF-ET妊娠者为对照组。两组年龄、不孕年限、既往妊娠史、胚胎移植数、胚胎评分、胚胎时期，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 标本采集

取两组外周血新鲜标本，在室温下静置1～2 h后，以2000 r/min的速度，分离血清上清液，置-70度深低温冰箱中待测；采用APA金标法定性及ELISA定量法完成7种磷脂-心磷脂（CL）、磷脂酰酸（PA）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰胆碱（PC）检测。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析处理，计数资料以百分数（%）表示，采用x2检验，计量资料以“x ±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组阳性率的比较

研究组有23例检测到阳性特异性抗磷脂抗体，阳性率为23%；对照组中仅有4例检测到阳性特异性抗磷脂抗体，阳性率4%，研究组阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组APA阳性率检测结果 [n（%）]

2.2 研究组7种特异性抗磷脂抗体（抗心磷脂抗体ACA、抗磷脂酰乙醇胺抗体APE、抗磷脂酰肌醇抗体API、抗磷脂酰酸抗体APA、抗磷脂酰甘油抗体APG、抗磷脂酰胆碱抗体APC和抗磷脂酰丝氨酸抗体（APS）IgG、IgM定量检测平均值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、表3。

表2 两组APA-IgG定量检测平均值结果

表3 两组APA-IgM定量检测平均值结果

3 讨 论

妊娠是一个复杂而又协调的过程，胚胎作为一种半同种移植物之所以能够维持取决于母胎间免疫关系的平衡，称之为免疫耐受状态或妊娠免疫耐受，而母体蜕膜组织和胎盘滋养层组织共同构成的母胎界面是妊娠免疫耐受的基础，一旦此免疫耐受遭到破坏将会导致RIF。早在2006年，Margalioth等[4]提出经过2～6个周期，移植≥10个高质量胚胎仍未妊娠者定义为RIF，美国反复种植失败发生率约19%。近年有研究发现体外受精-胚胎移植反复种植失败与自身免疫因素相关，而在各种自身抗体中，APA在反复种植失败过程中起着不可忽视的作用[5]。

磷脂普遍存在于动物体内，形成脂类双分子层骨架，是合成机体细胞膜的主要成分，也是构成胎盘绒毛膜的必需成分。磷脂在着床过程中作为粘着分子起修饰的作用。带负电荷的磷脂是抗磷脂抗体的靶抗原，它与中性磷脂类不同，一般位于细胞膜脂质双层的内层。在生理状态下带负电荷的磷脂并不暴露于细胞膜外表，从而不能被机体的免疫系统识别，只有在病理状态下带负电荷的磷脂才暴露于细胞膜的外表，一旦暴露于机体免疫系统即可产生抗磷脂抗体，抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂的异质性自身抗体的总称，APA不仅仅包括抗心磷脂抗体，而且还包括磷脂酰酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油及磷脂酰胆碱[6]。国外有研究显示APA与IVF-ET后的胚胎反复种植失败相关，其发生机制可能为：（1）血管栓塞导致胚胎种植部位的血供减少，导致胎盘功能不全；（2）APA直接与滋养层细胞相结合影响滋养层细胞功能，如抑制滋养层细胞转化为合体滋养层细胞、滋养层细胞的侵入、HCG的生成及种植。而滋养层细胞位于母胎界面，其特定的解剖学分布与独特的生物学功能是妊娠建立和维持的基础，是母体免疫识别和应答的直接靶细胞；（3）改变内皮细胞容受性[7-8]。

膜联蛋白V结合到滋养层细胞表面，通过防止凝血酶原复合物的形成和抑制促凝活性达到抗凝作用，从而防止血栓形成来维持正常妊娠，而APA影响了膜联蛋白V在滋养层细胞表面的表达，妊娠合并APAS阳性者，胎盘表面膜联蛋白V减少。Rote[9]的研究提示，APA能清除滋养细胞上的膜联蛋白V，并且能增强与凝血酶原的结合。在体外，膜联蛋白Ⅴ能与人凝血酶原结合。APA能清除凝血酶原上的膜联蛋白V且阻止正常的胚胎种植。以往研究也表明APA能识别受精卵并且对胚胎前期的发育有着不利影响。目前国内有研究报道反复种植失败患者外周血Foxp3及免疫抑制因子TGF-β1的表达降低、Treg细胞数目明显减少以及功能相关基因Foxp3的表达降低、白细胞介素-17表达明显增多、自然杀伤细胞的变化均可能是体外受精-胚胎移植反复种植失败的原因[10]。而本研究组共纳入100例IVF-ET后RIF者，其中23%检测有阳性抗磷脂抗体。此发生率与国外早期接受体外受精胚胎移植周期者以及体外受精治疗失败者抗磷脂抗体的阳性率一致[11]。研究组IgG、IgM阳性率分别为20%、3%，抗磷脂抗体的两种亚型IgG和IgM中，IgG容易引起死胎和血栓，而IgM主要导致流产[12]，而本研究组IgG和IgM同种型抗体比例较高，亦提示了抗磷脂抗体与IVF-ET后RIF的相关关系。而其他研究发现输卵管因素、男性因素和不明原因不孕症者的自身抗体发生率无显著差异。

以往仅评价复发性流产者中的抗心磷脂抗体具有显著危害，如果仅检测抗心磷脂抗体，将会导致仅检测到4%着床失败者具有阳性特异性抗磷脂抗体，漏诊81%与生殖免疫衰竭综合征相关的着床失败者[13]。而本研究结果表明其他磷脂抗体对女性IVF-ET后RIF的评估具有重要意义，抗磷脂抗体定性与定量测定与IVF-ET后RIF呈正相关，其为IVF-ET反复种植失败患者可经药物干预改善助孕妊娠结局提供了理论依据。

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本文编辑：刘帅帅

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B

ISSN.2095-8803.2017.01.048.03

湖南省科技厅科技计划项目：2014SK3155

唐君（1979-），女，硕士研究生，研究方向：复发性流产及人类辅助生殖技，E-mail：742976265@qq.com