人工模拟鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及其消毒处理

马文娟，石健春，冯秋实，李锦铨*，王小红

人工模拟鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及其消毒处理

马文娟，石健春，冯秋实，李锦铨*，王小红

食源性病原微生物污染造成的食源性疾病是当今世界上最严峻的食品安全问题之一[1-7]。沙门氏菌作为常见食源性致病菌，引起的细菌性食物中毒事件占全国此类事件的40%～60%，是食品安全检测中的重点监测对象[8]。蔬菜是人类的基本食物来源之一，可提供人体健康所必需的维生素、膳食纤维和矿物质等，在人们的膳食结构中具有特殊重要的地位。由于生鲜蔬菜能最大限度地保留营养元素，又能提供新鲜口感，有些生鲜蔬菜还可以减少一些癌症和心血管疾病等慢性疾病的发生，因此，生鲜蔬菜不论作为配菜、凉菜还是制作沙拉越来越受到广大群众青睐，如豆芽、生菜、香菜、黄瓜、番茄等[9-10]。然而，近年来一些研究表明，食源性病原微生物可以通过不同的途径进入到生鲜蔬菜中，并能在其中定居和不断生长、繁殖后代，这种现象通常称为病原菌定殖，此类菌即称为“内化菌”[11-12]。低浓度的次氯酸钠和硝酸银对果蔬的浸泡处理是最常见的表面化学消毒方法，能够有效杀灭果蔬表面的微生物，有学者研究表明[13]，用2%的次氯酸钠和1%的硝酸银分别对生鲜绿豆芽表面处理30 min和5 min，可有效去除表面的沙门氏菌，但对已经内化进去的沙门氏菌起不到很好的杀菌效果。所以，一般的清洗和消毒方法如次氯酸钠、硝酸银等消毒剂仅仅可以杀灭蔬菜表面的病原菌，而对于进入到蔬菜内部的病原菌是无法清除的。又因为生鲜蔬菜仅经过很少的处理和加工，而且常常直接生吃或凉拌后食用，食源性病原菌污染带来的风险非常大[14-18]。绿豆芽是绿豆种子萌发后长出数厘米长的幼芽，可作为蔬菜食用，称之为豆芽菜，人类自古就有食用豆芽菜的习惯，现代人喜之更甚[19]，但是随着对绿豆芽消费的不断增加，以沙门氏菌为首导致的食物源性疾病的爆发频率也不断增加[20-22]。例如2011年5月由德国蔓延并不断扩散至瑞典、丹麦、荷兰与英国等国的“毒豆芽”事件，让欧洲一时陷入恐慌，再一次给食源性疾病的防治敲响警钟。2011年6月13日止，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）公布数据显示德国34 人死亡，瑞典、丹麦、英国和荷兰在内的多个国家均已报告感染病例，全球共有3 255 例感染或者疑似感染病例[23]。

本研究以绿豆为作用载体，在绿豆发芽前期的4 个不同时段（0～48 h内），采用人工污染方式，接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，并在绿豆发芽的整个周期（绿豆的发芽周期约144 h）间隔取样分析，采用平板计数法，研究鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆芽中的内化定殖能力。在此基础上，采用紫外照射和化学消毒剂处理两种方法对定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌进行消毒处理，探索消除定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌的有效方法，为有效控制生鲜蔬菜中的内化病原菌提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028：实验室冷藏保存；绿豆购于武汉市洪山区梧桐路中百超市；白沙购于武汉市洪山区南湖大道花木城市场。

TSB胰蛋白胨大豆肉汤培养基、TSA大豆酪蛋白琼脂培养基、LB培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；硝酸银、无水乙醇、次氯酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

生化培养箱 SPX-250B型 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；5417R离心机 Eppendorf（中国）有限公司；TUV15W G15T8紫外灯 德国Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的活化及悬菌液的制备

取鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028平板（4 ℃条件下保存），无菌条件下挑取少许菌落于10 mL LB培养液中，37 ℃、120 r/min培养10 h。将培养液转移至50 mL离心管中，6 000 r/min离心10 min后，用磷酸盐溶液重复洗涤菌体3 次，获得菌悬液。用平板计数法计数菌悬液的细菌浓度，然后将其稀释至浓度为102、104、106、108CFU/mL备用。

1.3.2 无菌绿豆芽的准备

1.3.2.1 绿豆种子表面消毒处理

挑选表面完整无褶，颗粒饱满大小相当的绿豆种子20 颗，置于洁净干燥的烧杯中，加入80%酒精浸泡10 s，倾出酒精后加入1%硝酸银溶液浸泡5 min，最后用等体积无菌水清洗3 次[24-26]，于室温条件下干燥1 h备用。

1.3.2.2 绿豆发芽前期4 个不同时段样品的准备

用无菌镊子将经消毒处理的绿豆转移至已灭菌装有50 g白沙的三角锥形瓶中，添加15 mL无菌水使刚好没过白沙及绿豆，加塞封口，置于28 ℃的恒温箱中避光培养。在绿豆的发芽过程中，为了便于研究鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆芽中的定殖情况，将绿豆发芽的前期分为4 个不同的时段（0～48 h内）：吸胀期（G1，0 h）、萌动期（G2，0～12 h）、发芽初期（G3，12～24 h）、发芽期（G4，24～48 h），具体如图1所示。在经历上述发芽前期的4 个不同时段后，绿豆继续在28 ℃的恒温箱中避光培养进行发芽，绿豆从种子发芽到可以食用阶段的整个生长周期约为144 h。

图1 绿豆发芽前期的4 个不同时段（0～48 h内）Fig. 1 Mung bean sprouts at four different stages of pre-germination (0-48 h)

1.3.3 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆芽中内化定殖能力

1.3.3.1 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028人工污染绿豆芽样品的准备

按1.3.2.2节方法准备好绿豆发芽前期4 个不同时段（0～48 h内）的样品，按照每瓶4 mL的接菌量，将1.3.2.1节活化的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028菌悬液接种到培养有不同时段的吸胀期（G1，0 h）、萌动期（G2，0～12 h）、发芽初期（G3，12～24 h）、发芽期（G4，24～48 h）绿豆芽的样品中。接种完毕后，置于28 ℃恒温箱中继续避光培养，并在绿豆从种子发芽到可以食用的整个生长周期（约为144 h）的不同时间段，取出一定量的样品，备用，每个样品做3 个平行，即每24 h进行取样和平板菌落计数，用来研究不同接种浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆的不同发芽时期在绿豆芽中的内化定殖能力。以接种量102CFU/mL为例，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆发芽前期的接种时间和绿豆芽样品的取样时间见表1。

表1 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028（接种量102CFU/mL）在绿豆发芽前期的接种时间和绿豆芽样品的取样时间Table 1 Inoculation time of Samonella typhimurium ATCC14028 (at 102CFU/mL) during pre-germination and sampling time of mung bean sprouts

1.3.3.2 绿豆芽样品的表面消毒处理

将装有不同发芽阶段鼠伤寒沙门氏菌人工污染的绿豆芽样品（1.3.3.1节方法制备）的三角瓶从28 ℃恒温箱中取出，用无菌镊子从中取出两根绿豆芽，分别置于10 mL无菌EP管中，用80%酒精溶液浸泡处理10 s，1% AgNO3处理5 min，最后用等体积无菌水清洗3 次，备用[27-29]。该方法可有效去除黏附在绿豆芽表面的沙门氏菌，而无法清除已经内化定殖在绿豆芽内部的沙门氏菌。

1.3.3.3 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的计数

将1.3.3.2节制备得到的表面消毒处理的绿豆芽中加入500 μL的磷酸盐缓冲液，无菌匀浆棒匀浆，并进行10 倍次梯度稀释。吸取100 μL 3 个不同稀释倍数的稀释液于TSA平板上，并用无菌涂布棒涂布均匀。将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h后进行菌落计数，以观察鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力。实验中，每份绿豆芽样品平行取样，并重复3 次，菌落平板计数严格遵循计数规则。

1.3.4 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的消毒处理

1.3.4.1 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028样品的准备

按1.3.2.1节方法分别准备鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的菌悬液和表面消毒处理的绿豆种子。用无菌镊子将经消毒处理的绿豆转移至已灭菌装有50 g白沙的三角锥形瓶中，添加15 mL无菌水使刚好没过白沙及绿豆，接种106CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028后加塞封口，置于28 ℃的恒温箱中避光培养144 h。144 h后，取一定量的绿豆芽样品进行绿豆芽样品的表面消毒处理，然后再用3 种消毒方法分别处理。

1.3.4.2 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028样品的3 种消毒处理

将1.3.4.1节得到的已表面消毒处理的绿豆芽样品，采用以下3 种方法分别进行处理，观察这3 种消毒方法对绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的处理效果。消毒方法如下[30]：

紫外线照射处理：将紫外处理箱提前开灯照射10 min。然后将绿豆芽样品放入无菌空培养皿中，开盖置于紫外处理箱中灯下垂直照射的同一位置以获取同等的照射强度，分别照射处理10、20、30 min。

次氯酸钠溶液消毒处理：分别用不同质量浓度（0.005、0.010、0.020 g/100 mL）的次氯酸钠溶液对绿豆芽样品进行浸泡处理10 min。

硝酸银溶液消毒处理：分别用不同质量浓度（0.5、1.0、2.0 g/100 mL）的硝酸银溶液对绿豆芽样品进行浸泡处理10 min。

1.3.4.3 3 种消毒方法处理后的绿豆芽样品中残留内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的计数

将1.3.4.2节3 种消毒方法处理后的绿豆芽用无菌水清洗3 次，按1.3.3.3节方法进行内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的计数，同时以未进行消毒处理的绿豆芽样品作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆发芽前期4 个不同时段的内化定殖能力分析

以绿豆为作用载体，采用人工污染的方式，在绿豆发芽前期4 个不同时段（0～48 h内）接种同一浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，比较相同浓度的鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽不同时期中的内化定殖能力，以掌握鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028内化定殖于绿豆芽组织中的关键时期，结果如图2所示。

图2 ATCC14028在绿豆芽中的内化定殖能力与接种时期的关系Fig. 2 Relationship between internalization capacity and inoculation time of ATCC14028

由图2A可知，当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028浓度为102CFU/mL时，在绿豆发芽前期的发芽初期（G3）接种，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的内化能力最强，内化菌量可以达到104CFU/g；当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028浓度为104CFU/mL时，在绿豆发芽前期的吸胀期（G1）、萌动期（G2）、发芽初期（G3）接种，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的内化菌量变化不大，最大值均约为105CFU/g（图2B）；当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028浓度为106CFU/mL时，在绿豆发芽前期的吸胀期（G1）接种，内化菌量最大，可达107CFU/mL左右（图2C）；当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028浓度为108CFU/mL时，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的内化菌量依次是G1＞G2＞G3＞G4（图2D）。但在绿豆发芽的生长周期（约为144 h）结束时，4 个不同接种时段的鼠伤寒沙门氏菌的内化量趋于相同。

2.2 不同浓度鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆发芽前期同一接种时段时内化定殖能力分析

以绿豆为作用载体，采用人工污染的方式，在绿豆发芽前期（0～48 h内）的同一接种时段接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，比较不同浓度鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆发芽过程中内化定殖能力，结果如图3所示。

图3 ATCC14028的内化能力与接种浓度的关系Fig. 3 Relationship between internalization capacity and inoculation concentration of ATCC14028

由图3A可知，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在绿豆芽中的内化能力与其接种浓度基本呈正相关，当接种浓度为108CFU/mL时，绿豆芽生长第72～120小时，内化量最高可达到107CFU/mL左右。由图3B可知，当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种浓度为102CFU/mL，在绿豆芽发芽的前96 h中，鼠伤寒沙门氏菌基本未内化到绿豆芽中，在第120、144小时才有约104CFU/g的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028内化到绿豆芽中。从整体上来说，随着鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种浓度的加大，绿豆芽中内化的菌量也随之增加，接种浓度为108CFU/mL时，菌的内化能力最强。图3C表明，102、104、106CFU/mL这3 个接种浓度对应的绿豆芽中鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的内化量差别不大，最大值约为105CFU/g；但均低于接种浓度为108CFU/mL的内化菌量。图3D表明，在发芽期（G4）接种时，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种浓度为108CFU/mL时内化能力最强， 106CFU/mL次之。

2.3 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的消毒处理

在销售和食用前对已收获的新鲜农产品进行消毒处理是必不可少的。本研究中在绿豆芽的发芽过程中人工污染鼠伤寒沙门氏菌（106CFU/mL），以模拟绿豆芽发芽过程中受到病原菌污染的状态，采收后通过3 种消毒方法对比处理已经内化了沙门氏菌ATCC14028的绿豆芽，探索消除内化定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌的有效方法，结果如图4所示。

紫外线照射是一种传统的非热杀菌方法，公众接受度高。由图4可知，采用紫外照射消毒处理，对收获后绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028有明显的去除效果。绿豆芽中内化的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028从紫外线照射的10 min之后开始显著降低，当紫外线照射处理30 min内化鼠伤寒沙门氏菌可减少约4 （lg（CFU/g））。低质量浓度的次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理是常见的表面化学消毒处理方法，能够有效杀灭果蔬表面的微生物，但图4的结果表明，采用次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理，对收获后绿豆芽中内化的鼠伤寒沙门氏菌的去除效果并不明显，其原因有待于进一步研究。

图4 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的消毒处理Fig. 4 Disinfection of ATCC14028 in mung bean sprouts after different treatments

3 结 论

本实验采用人工模拟污染实验，研究了鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及影响因素。结果表明：当鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种浓度为102CFU/mL时，在绿豆发芽前期（0～48 h内）中发芽初期（G3，12～24 h）的内化能力最强。当接种浓度大于104CFU/mL时，在绿豆发芽前期的吸胀期（G1）内化能力最强，发芽期（G4）最弱。当接种浓度为108CFU/mL时，鼠伤寒沙门氏菌的内化定殖量最高可达到1.1×107CFU/g。对同一浓度鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽前期4 个不同时段（0～48 h内）接种时在绿豆芽中的内化定殖能力分析可知，在吸胀期，鼠伤寒沙门氏菌内化程度基本与接种浓度呈正相关。出现这一现象的原因可能是在该阶段接种，沙门氏菌与绿豆芽接触的时间周期最长，并且绿豆种子在发芽初期会迅速吸水，沙门氏菌会随着水分进入种子内，随着绿豆芽的生长在其组织中定殖与繁殖；对不同浓度鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽前期（0～48 h内）同一接种时段时在绿豆芽中的内化定殖能力分析可知，鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化能力与其接种浓度近似呈正相关，随着鼠伤寒沙门氏菌接种浓度的加大，绿豆芽中内化的菌量也随之增加，其中接种浓度为108CFU/mL时，菌的内化能力最强。对绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌的消毒处理结果表明，紫外照射消毒处理对内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌有明显的去除效果，但不能完全清除，而次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理对内化的鼠伤寒沙门氏菌的去除效果并不明显。此结果表明，食源性病原菌一旦污染新鲜农产品很难完全消除，传统的消毒方法虽然可以减少表面微生物数量，但不能消除已内化定殖在农产品内部的病原微生物，食用该类新鲜农产品具有一定的安全风险。

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（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

以绿豆为作用载体，研究鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028在不同发芽阶段的绿豆芽中的内化定殖能力及其影响因素，在此基础上，采用紫外照射和化学消毒剂处理两种方法对定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌进行消毒处理，探索消除绿豆芽中定殖的鼠伤寒沙门氏菌的有效方法。结果表明：在绿豆发芽前期的4 个不同的时段（0～48 h内）：吸胀期（G1，0 h）、萌动期（G2，0～12 h）、发芽初期（G3，12～24 h）、发芽期（G4，24～48 h），分别接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028（102、104、106、108CFU/mL），鼠伤寒沙门氏菌在豆芽中的内化定殖能力不同，但在绿豆发芽的生长周期（约为144 h）结束时，4 个不同接种时段的鼠伤寒沙门氏菌的内化量趋于相同。对绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌的消毒处理结果表明，紫外照射消毒处理对内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌有明显的去除效果，而次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理对内化的鼠伤寒沙门氏菌的去除效果并不明显。

绿豆芽；鼠伤寒沙门氏菌；内化；消毒处理

Internalization and Colonization Capacity of Salmonella typhimurium in Artif i cially Contaminated Mung Bean Sprouts and Its Disinfection

MA Wenjuan, SHI Jianchun, FENG Qiushi, LI Jinquan*, WANG Xiaohong
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this investigation, the internalization and colonization capacity of Salmonella typhimurium ATCC14028 in artif i cially contaminated mung bean sprouts during different germination stages was studied. Furthermore, two different disinfection methods of ultraviolet irradiation and chemical disinfectant treatment were developed to eliminate internalized Salmonella typhimurium effectively. During four different stages (0-48 h) of pre-germination of mung bean namely expansion (G1, 0 h), budding (G2, 0-12 h), early germination (G3, 12-24 h) and germination (G4, 24-48 h), Salmonella typhimurium had different internalization and colonization capacities at different inoculation concentrations (102, 104, 106and 108CFU/mL), which, however, tended to be identical at the end of the growth cycle (about 144 h). In addition, our results showed that ultraviolet radiation could effectively eliminate internalized Salmonella typhimurium while dipping in a mixed solution of sodium hypochlorite and silver nitrate solution had no such effect.

mung bean sprout; Salmonella typhimurium; internalization; disinfection treatment

10.7506/spkx1002-6630-201707033

TS252.1

A

1002-6630（2017）07-0207-06

马文娟, 石健春, 冯秋实, 等. 人工模拟鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及其消毒处理[J]. 食品科学, 2017, 38(7): 207-212. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707033. http://www.spkx.net.cn

MA Wenjuan, SHI Jianchun, FENG Qiushi, et al. Internalization and colonization capacity of Salmonella typhimurium in artif i cially contaminated mung bean sprouts and its disinfection[J]. Food Science, 2017, 38(7): 207-212. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707033. http://www.spkx.net.cn

2016-04-20

湖北省科技支撑计划项目（2014BBB016）；华中农业大学“国家级大学生创新创业训练计划”项目（2016105042016067）

马文娟（1991—），女，硕士研究生，主要从事食品微生物与食品安全研究。E-mail：1252539627@qq.com

*通信作者：李锦铨（1986—），男，副教授，博士，主要从事食品生物技术与安全研究。E-mail：lijinquan@mail.hzau.edu.cn