五种芽苗菜黄酮提取物的体外抗氧化活性研究

李执坤，陈虹竹，冯艳钰，张超，王淇，臧延青

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

五种芽苗菜黄酮提取物的体外抗氧化活性研究

李执坤，陈虹竹，冯艳钰，张超，王淇，臧延青

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

以苜蓿、小麦、松柳、红豆、空心菜五种芽苗菜为原料，在80%乙醇，60℃，料液比1∶15（m·v-1），2 h的提取条件下提取黄酮化合物，并研究了其体外抗氧化活性，包括对超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除能力和对铁离子的还原能力。试验结果表明芽苗菜黄酮提取物具有良好的体外抗氧化活性，且活性与浓度呈现一定的量效关系。研究为功能食品原料的开发利用提供了理论依据。

芽苗菜；黄酮提取物；体外抗氧化活性

芽苗菜也称黄金菜、神仙菜、活体菜，是用谷类、豆类、树等的种子培育出的可食用“芽菜”。目前，市场上常见的芽苗菜有大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、苜蓿、香椿、荞麦、萝卜等30多个品种[1-2]。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，芽苗菜作为一种富含营养、优质、无污染的绿色食品，因其风味独特并具有“药食同源”的保健功效而越来越受到消费者的喜爱。

黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，在清除人体内超氧阴离子、降血凝、抗衰老、增强免疫力、抵抗DNA损伤等很多方面都具有良好的生理活性[3]。近些年，芽苗菜生物成分的活性得到了一定的证实，芽苗菜在萌发过程中不仅维生素、矿物质等营养成分增多，其他生物活性物质如黄酮类物质也明显增多，具有良好的抗氧化功效，对于癌症、冠心病等具有良好的预防及一定的治疗效果[4-6]。 芽苗菜具有占地面积小，生产周期短，单位面积产量高，季节性影响小、清洁无污染、营养价值高等特点，因而具有广阔的发展前景[7]。试验提取了苜蓿、小麦、松柳、红豆、空心菜五种芽苗菜的黄酮化合物，并比较研究了提取物的体外抗氧化活性，为芽苗菜产品的综合开发利用提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松柳、红豆、空心菜、紫花苜蓿购于山东菏泽，小麦（垦九）产自黑龙江垦区。

DZG-6050SA型真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信公司；722 s分光光度计，上海分析仪器总厂制造；HH-1数显恒温水浴锅，江苏省荣华仪器制造有限公司；HH.W21.600型电热恒温水箱，江苏省荣华仪器制造有限公司；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芽苗菜的培育

将洗净的种子以种子体积2～3倍的蒸馏水浸泡24～36 h。搓去粘液用清水漂洗干净，沥干水分，放在平底容器内，上盖湿纱布，置于23～26℃恒温处催芽48 h，至芽长2～3 mm。之后将种子均匀地撒到育苗盘中，盖上湿纱布。培育期间棚室温度保持在18～23℃之间。每天喷水3次。待植株长至10～12 cm时去掉种皮及其他杂质，于60℃鼓风干燥箱中干燥，粉碎，40目过筛备用[8-11]。

1.2.2 黄酮的提取

目前，关于黄酮提取的工艺已相当成熟，采用Kim[12-13]等的方法，称取2.00 g芽苗菜粉末，以80%乙醇为溶剂，物料比1∶15，60℃提取两次，每次2 h，合并上清液，3 000 r·min-1离心，过滤。将滤液置于洁净分液漏斗中，加入氯仿15 mL，甲醇15 mL，充分震荡后加入30 mL蒸馏水，充分静置后，取上层液体于平皿中，置于真空干燥箱60℃干燥，密封冷藏备用。

1.2.3 黄酮含量的测定

采用氯化铝法，以芦丁为标准品，确定吸光度与芦丁浓度之间的关系，得出芽苗菜中黄酮的含量。准确配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1芦丁标准液，分别取3 mL置于25 mL试管中，加入3 mL AlCl3乙醇溶液（2%w·v-1）静置15 min，在430 nm处测吸光度值，获得芦丁标准曲线方程[1]。

称取干燥后的黄酮提取物，配成一定浓度溶液，将样品的吸光度代入标准回归方程，计算黄酮粗提物中黄酮的含量，从而计算出芽苗菜中黄酮的含量。

1.2.4 芽苗菜黄酮对O2-·的清除作用

取提取的黄酮粗品稀释为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1浓度的样液，备用。向10 mL试管中加入5 mL pH=8.4的磷酸盐缓冲液，2 mL不同浓度的SF样液，0.1 mL 4.5 mmol·L-1邻苯三酚溶液。25℃恒温水浴10 min后，加入2滴盐酸终止反应，于420 nm处测定吸光度值，记为Ai。同时，向空白管依次加入5 mL pH=8.4的磷酸盐缓冲液，2 mL蒸馏水，0.1 mL 4.5 mmol·L-1邻苯三酚溶液。420 nm处测定吸光度值，记为Aj。用TP代替SF进行阳性对照，每个样品重复3次实验[15]。

超氧阴离子清除率按如下公式计算：

1.2.5 芽苗菜黄酮对DPPH的清除作用

将黄酮提取物稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1浓度的样液。用95%乙醇配制4×10-4M的DPPH溶液，在10 mL试管中先后加入各3 mL DPPH、2 mL样液，室温避光静置1 h，于517 nm处读数，每个样品进行3次平行试验。

DPPH清除率按如下公式计算：

1.2.6 芽苗菜黄酮的还原能力测定（铁氰化钾还原力）

参照张红城等[1]的方法，在25 mL试管中先后加入2.5 mL pH=6.6磷酸缓冲溶液，1 mL不同浓度的提取物溶液（空白管加80%乙醇），2.5 mL 1%铁氰化钾，50℃恒温加热20 min，加10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r·min-1离心分离，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%FeC13，混合均匀，避光静置10 min后在700 nm波长下测吸光度A值，计算还原力，每个样品重复3次实验。

还原力=[（A样品-A空白）/A空白]×100%

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线方程为y=8.021 4x+0.005 8，相关系数为0.999 2。利用芦丁标准曲线方程，得出芽苗菜黄酮含量如表1。

表1 芽苗菜黄酮含量Table 1 Flavonoids content of SF

2.2 芽苗菜黄酮对O2-·的清除作用

图1 SF对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.1 The scavenging ability of SF against superoxide radicals

超氧阴离子自由基不仅自身具有毒性，而且能够通过一系列反应生成其他氧离子自由基，对生物体产生进一步的损害作用[17]。 在碱性条件下邻苯三酚能迅速自氧化产生O2-·，加速邻苯三酚的自氧化，产生有色中间产物，次有色中间产物在325 nm具有强烈的光吸收，由于O2-·的浓度决定了自氧化速率，清除O2-·抑制了自氧化反应，阻止中间产物的积累，由此来评价样品清除O2-·的能力[18]。

由图2可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的样品浓度中，SF对超氧阴离子自由基具有一定的清除活性。不同品种芽苗菜黄酮提取物对O2-·的清除效果随着样品浓度的逐渐递增，在0.5 mg·mL-1时达到最大，此浓度下，清除率分别达到苜蓿（15.70%），小麦（34.12%），红豆（41.90%），松柳（41.38%），空心菜（36.78%），其O2-·清除能力顺序为：红豆＞松柳＞空心菜＞小麦＞苜蓿。

2.3 芽苗菜黄酮对DPPH的清除作用

图2 SF对DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging ability of SF against DPPH free radicals

由图3可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的样品浓度中，SF对DPPH具有一定的清除能力。清除效果随着样品浓度的逐渐递增，在0.5 mg·mL-1时达到最大，此浓度下，清除率分别达到苜蓿（11.36%），小麦（26.90%），红豆（14.01%），松柳（49.52%），空心菜（25.31%），其DPPH清除能力顺序为：红豆＞小麦＞空心菜＞松柳＞苜蓿。

2.4 芽苗菜黄酮还原力的测定

在三氯化铁/铁氰化钾混合溶液中，样品中的还原性物质可将Fe3+还原成Fe2+，形成一种蓝色化合物，使得溶液吸光度增大，该化合物在700 nm处有最大吸收值。所以通过溶液的吸光度的变化来评价还原力的大小。以此来评价芽苗菜提取物的抗氧化活性[19-20]。

图3 SF还原力的测定Fig.3 The reduction ability of SF

由图4可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的样品浓度范围，随着浓度的逐渐增加，SF的还原力均逐渐递增，在0.5 mg·mL-1时达到最大，五种芽苗菜黄酮提取物均对Fe3+表现出一致的还原能力。其还原能力顺序为：小麦＞松柳＞空心菜＞红豆＞苜蓿。

根据Gil ES[21]等人的研究，抗氧化能力的强弱与黄酮上活性基团的数量与所处的位置有关。也有研究表明，拥有邻位羟基芳香环的黄酮具有较高的抗氧化活性[22]。此外，黄酮的结构并不是影响抗氧化能力的唯一原因，Ndhlala等[23]通过对黄酮提取物及其分离组分的抗氧化研究，发现黄酮提取物的抗氧化活性均高于分离组分，表明了黄酮类物质的抗氧化能力具有协同或者叠加作用。

3 讨论

苜蓿、小麦、红豆、松柳、空心菜五种芽苗菜黄酮提取物均表现了对O2-·和DPPH自由基的清除能力，对Fe3+具有良好的还原能力，并且呈现一定的量效关系。综合各项抗氧化能力指标，红豆、松柳、小麦SF的抗氧化活性较好，苜蓿的抗氧化能力稍差。不同品种芽苗菜黄酮提取物对DPPH、超氧阴离子自由基、Fe3+的清除能力表现出较大的差异，这可能是由不同品种芽苗菜含有的黄酮类物质的含量、黄酮的组成结构的差异以及不同黄酮类物质的协同叠加作用所导致的。此外，提取物中可能少量含有其他酚类物质，这也是影响其抗氧化活性的可能原因。实验初步研究了芽苗菜中黄酮类物质的含量及其抗氧化能力的差异，其抗氧化能力差异的反应机理有待进一步的研究。

4 结论

苜蓿、小麦、红豆、松柳、空心菜五种芽苗菜黄酮具有一定的体外抗氧化能力，作为功能性食品原料具有广阔的开发利用前景。

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Antioxidative Activities in Vitro Study on Flavonoids Extracts from Five Sprouts

Li Zhikun，Chen Hongzhu，Feng Yanyu，Zhang Chao，Wang Qi，Zang Yanqing
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The antioxidative activities in vitro of the flavonoids from sprouts of Water Spinach，Pine Willow，Red Bean，Wheat，and Alfalfa were studied.The extraction condition was extraction solvent 80%ethanol，extraction temperature 60℃，solid-liquid ratio1∶15，extraction time 2 hours.Antioxidative activities including superoxide radical（O2-·），1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH）and Ferric iron of the flavonoids were studied.The results showed that the sprouts flavonoids had good antioxidant abilities in vitro.Activity and concentration indicated certain relationship.The research provided theory basis for the development and utilization of functional food ingredients.

sprouts;flavonoids;antioxidant activities in vitro

Q539

A

1002-2090（2017）02-0048-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.010

2016-05-20

2015年省级大学生创新训练项目（201510223022）。

李执坤（1993-），男，黑龙江八一农垦大学食品学院食品质量与安全专业2013级本科生。

臧延青，讲师，E-mail：byndzangyanqing@163.com。