哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞增殖及HIF-1α表达的影响

杨小飒，刘冬莹，李 杰，衣泰龙，涂 悦，程世翔

(1.武警后勤学院附属医院 脑科医院，天津 300162；2.天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162；3.武警天津总队第六支队卫生队，天津 300410)

临床医学研究

哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞增殖及HIF-1α表达的影响

杨小飒1,2，刘冬莹3，李 杰1，衣泰龙1，涂 悦1,2，程世翔1,2

(1.武警后勤学院附属医院 脑科医院，天津 300162；2.天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162；3.武警天津总队第六支队卫生队，天津 300410)

目的 探索哇巴因(Ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法 Ouabain(0.05、0.5、2.5、25 μmol/L)作用于U87-MG细胞24 h，MTT法检测吸光度值和细胞活力，Western Blot检测HIF-1α表达量。结果 不同浓度Ouabain干预24 h后U87-MG细胞吸光度值(OD490)与Control组相比，均明显降低(P均<0.01)，细胞活力显著下降(P<0.01)；与Control组比较，0.05 μmol/L Ouabain组HIF-1α蛋白表达量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05，P<0.05)，当Ouabain浓度升高至2.5、25 μmol/L，HIF-1α表达显著降低(0.28±0.04，0.20±0.03vs.1.00±0.05，P均<0.01)。结论 较高浓度Ouabain可通过抑制HIF-1α表达，促进人胶质瘤U87-MG细胞凋亡。

哇巴因；人胶质瘤U87-MG细胞；缺氧诱导因子-1α；凋亡

神经胶质瘤(Glioma)是目前最常见的原发性颅内肿瘤之一，其起源于神经上皮，恶性程度较高，约占颅脑肿瘤的40%～50%[1]。神经胶质细胞的过度分化和迁移是胶质瘤的病理基础，目前临床上主要采取手术治疗联合放化疗，但由于胶质瘤的侵袭性使根治性肿瘤切除术无法实施，因而患者的生存中值较短，临床预后较差[2]。为了改善胶质瘤的临床现状，新的治疗方案亟待发展。

哇巴因(Ouabain)作为一种强心苷类药物，由于能够抑制Na+/K+-ATP酶活性产生正性肌力作用而被广泛用于治疗充血性心力衰竭和心率失常[3]。最近研究表明，Ouabain可通过提高胞质内钙离子水平、抑制细胞周期等，参与调节MAPK、Ras、Akt/mTOR等信号转导通路，诱导胶质瘤、肾上腺皮质腺瘤和肺癌等多种肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞的放化疗敏感性[4]。另外，流行病学研究也表明，使用Ouabain等强心苷类药物能够降低肿瘤患者的死亡率[5]。以上研究结果均提示Ouabain具有一定的抗癌特性，但目前关于其在肿瘤治疗中的作用机制尚不明确。

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是缺血缺氧环境下激活的一种重要转录因子，参与调节机体对缺氧的耐受[6]。研究表明，胶质瘤细胞的快速生长导致氧气消耗过度，由此引发的缺氧环境使HIF-1α呈现高表达状态，并介导其下游多种靶基因促进肿瘤细胞生长，增强肿瘤细胞侵袭力和迁移能力以及化疗药物的耐受性，与胶质瘤的发生发展密切相关[7]。然而，使用强心苷类药物地高辛可阻断胶质瘤诱导的HIF-1α产生从而抑制血管再生，提高胶质瘤小鼠的存活率[8]。这表明，强心苷类药物在胶质瘤中抗癌作用的发挥可能与HIF-1α有关。

因此，本研究使用强心苷类药物Ouabain干预人胶质瘤U87-MG细胞，以验证Ouabain对胶质瘤的抑制作用，并探索其作用机制与HIF-1α的关系，旨在为胶质瘤的药物治疗提供更多实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人胶质瘤U87-MG细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，Ouabain(美国Sigma公司)，高糖培养基(DMEM)、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Promega公司)，兔抗人一抗HIF-1α、β-actin(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国KPL公司)，化学发光成像系统(美国GE公司，Amersham Imager 600)，酶标仪(美国Thermo fisher公司，51119300)。

1.2 细胞培养和实验分组 人胶质瘤U87-MG细胞使用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)置于5% CO2、37℃培养箱进行培养，待细胞汇合度达90%后消化传代，正常培养7 d后进行后续实验。实验分为：正常对照组(control)和Ouabain组(0.05、0.5、2.5、25 μmol/L)，control组不进行Ouabain干预。

1.3 MTT法检测细胞存活率 将U87-MG细胞以4 000个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置4个复孔，常规培养24 h后Ouabain组加入不同浓度Ouabain继续培养24 h，control组细胞加入等体积的DMEM高糖培养基，空白孔仅加入等体积的DMEM高糖培养基，培养相同时间后每孔加入20% MTT，置于37℃培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定490 nm处的吸光度值(optical density，OD490)，计算细胞活力 =(OD490实验孔-OD490空白孔)/(OD490对照孔-OD490空白孔)×100%。

1.4 Western Blot检测HIF-1α蛋白表达量 U87-MG细胞经不同浓度Ouabain处理24 h后，使用预冷PBS漂洗细胞3次，加入SDS蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，静置1 min后，用细胞刮收集细胞至1.5 mL离心管，使用破碎仪3 500次/min破碎2 min，12 000 rpm离心取上清，-80℃保存待用。将制备好的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，HIF-1α一抗(兔抗，1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST充分洗膜，羊抗兔二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBST充分洗膜。滴加化学发光剂ECL，使用化学发光成像系统显影后采用ScnImage灰度分析软件进行分析，以目的蛋白与β-actin的蛋白条带灰度值之比作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 Ouabain对U-87MG细胞活力的影响 MTT结果显示，不同浓度Ouabain处理24 h后U87-MG细胞OD490与control组比较，均显著降低(P均<0.01)，细胞活力较control组显著下降(P均<0.01,见表1)。

表1 Ouabain处理24 h后U87-MG细胞OD490和细胞活力

检测指标药物浓度00.05μmol/L0.5μmol/L2.5μmol/L25μmol/LOD4900.97±0.090.70±0.10**0.41±0.09**0.40±0.08**0.34±0.09**细胞活力(%)10072.30±5.66**42.50±5.51**41.34±4.64**34.86±5.77**

每组设置4个复孔；与control组相比，**P<0.01。

2.2 Ouabain对HIF-1α表达的影响 与control组比较，0.05 μmol/L Ouabain组HIF-1α蛋白表达量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05，P< 0.05)，当Ouabain浓度升高为2.5、25 μmol/L时，HIF-1α表达均显著降低(0.28±0.04，0.20±0.03vs.1.00±0.05，P均<0.01)；另外，0.5 μmol/L Ouabain组的HIF-1α蛋白表达量与对照组相比无明显差异(0.88±0.03vs.1.00±0.05，P> 0.05,见图1)。

与control组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。 图1 Ouabain作用于U87-MG细胞24 h后的HIF-1α表达变化

3 讨论

胶质瘤作为侵袭性最高的脑肿瘤，具有较高的复发率和死亡率，近年来关于其治疗方案的研究备受瞩目[9]。Ouabain等强心苷类药物作为Na+/K+-ATP酶的特异性抑制剂，近年来被发现具有一定的肿瘤抑制作用[10]。另外，强心类药物被证实能够抑制胶质瘤诱导的HIF-1α表达，阻止肿瘤的病理进展。基于此，本实验利用国内外常用于研究胶质瘤的U87-MG细胞构建胶质瘤体外模型，不同浓度Ouabain干预U87-MG细胞24 h，以此来探究Ouabain对于U87-MG细胞凋亡和HIF-1α表达的影响。

Ouabain能够抑制Na+/K+-ATP酶、降低钠离子浓度梯度，从而增加胞内钙离子浓度、激活心肌细胞上的收缩元件，产生正性肌力作用而被用于治疗充血性心脏病[11]。研究表明，作为Na+/K+-ATP酶的特异性抑制剂，Ouabain等强心苷类药物通过降低Na+/K+-ATP酶α亚基的含量，可能影响肿瘤细胞的粘附和转移，从而引起恶性乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、人白血病细胞等肿瘤细胞凋亡[12]。另外，Ouabain被报道能够通过抑制Na+/K+-ATP酶α亚基与糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B的相互作用，阻断PI3K/Akt和MEK/ERK通路，从而减弱胶质瘤细胞的迁移能力，抑制肿瘤细胞的生长[13]。本研究中，MTT结果表明，不同浓度Ouabain均导致U87-MG细胞活力降低，且具有一定的浓度依赖性，这表明Ouabain能够抑制人胶质瘤U87-MG细胞的生长，与前者的研究结果相一致，均证实了Ouabain的抗癌特性。

为了进一步探讨Ouabain促进U87-MG细胞凋亡的可能机制，我们检测了HIF-1α的表达变化。HIF-1α是细胞内维持氧平衡的重要调节因子，包含 826 个氨基酸，分子量为 92.7 kD，其在常氧条件下经泛素化途径而降解，当体内发生缺氧时可在组织内发生堆积，并通过调节糖酵解相关酶活性和调节线粒体功能来降低氧耗，使机体适应缺氧环境[14]。恶性肿瘤的无限增殖特性可导致细胞内氧代谢异常，并造成细胞内缺氧微环境，从而刺激HIF-1α的稳定。充足的HIF-1α可通过促进肿瘤细胞自我更新、调节细胞代谢及胞内葡萄糖利用，对肿瘤细胞生长、增殖、转移起到促进作用，并可能触发癌细胞侵袭和迁移以及放化疗耐受[15]。

研究表明，除了环境中氧浓度的直接调节，Akt/mTOR信号通路也被证实能够在转录水平促进HIF-1α的稳定和积累[16]。而Akt/mTOR通路能够抑制胶质瘤病理过程中的程序性细胞死亡，从而导致胶质细胞的过度分化，加剧胶质瘤的恶性发展[17]。李杰[18]等研究发现，ouabain能够抑制人胶质瘤U251细胞的增殖，使其出现S期阻滞，同时高浓度的Ouabain能够下调Akt、mTOR以及HIF-1α。在本研究中，Western Blot结果表明，在0.05 μmol/L Ouabain组，HIF-1α表达增加，这可能由于较低浓度的Ouabain对U-87MG细胞中Na+/K+-ATP酶的轻度抑制导致细胞处于较高代谢水平且相对缺氧的状态，因而刺激了HIF-1α的表达上调。但随着Ouabain浓度的增加，HIF-1α表达也逐渐降低。MTT和Western Blot结果提示，较高浓度Ouabain在抑制胶质瘤细胞增殖的同时，也导致HIF-1α表达下调。这与李杰等的研究结果一致由此我们推测，较高浓度的Ouabain可能通过抑制Akt/mTOR信号通路，进而下调下游蛋白HIF-1α的表达，减弱细胞生长能力，从而引起肿瘤细胞凋亡。

综上所述，本实验采用不同浓度Ouabain干预人胶质瘤U87-MG细胞，发现Ouabain可通过抑制HIF-1α表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，这为胶质瘤的药物治疗提供了实验依据，提示Ouabain可作为临床治疗胶质瘤的潜在药物。

[1] Wang H Y,Wang W,Liu Y W,et al.Role of KCNB1 in the prognosis of gliomas and autophagy modulation[J].Sci Rep,2017,7(1):14.

[2] Wang G,Liu M,Wang H,et al.Centrosomal protein of 55 regulates glucose metabolism,proliferation and apoptosis of glioma cells via the Akt/mTOR signaling pathway[J].J Cancer,2016,7(11):1431-1440.

[3] Blaustein M P,Chen L,Hamlyn J M,et al.Pivotal role of α2 Na(+) pumps and their high affinity ouabain binding site in cardiovascular health and disease[J].J Physiol,2016,594(21):6079-6103.

[4] Yan X,Liang F,Li D,et al.Ouabain elicits human glioblastoma cells apoptosis by generating reactive oxygen species in ERK-p66SHC-dependent pathway[J].Mol Cell Biochem,2015,398(1-2):95-104.

[5] Prassas I,Diamandis E P.Novel therapeutic applications of cardiac glycosides[J].Nat Rev Drug Discov,2008,7(11):926-935.

[6] 刘波,石京山,龚其海.缺氧诱导因子-1的稳定性调节[J].遵义医学院学报,2012,35(6):548-552.

[7] Tang J H,Ma Z X,Huang G H,et al.Downregulation of HIF-1a sensitizes U251 glioma cells to the temozolomide (TMZ) treatment[J].Exp Cell Res,2016,343(2):148-158.

[8] Nigim F,Cavanaugh J,Patel A P,et al.Targeting hypoxia-Inducible factor 1α in a new orthotopic model of glioblastoma recapitulating the hypoxic tumor microenvironment[J].J Neuropathol Exp Neurol,2015,74(7):710-722.

[9] 王 敏,林 茂,马晓莉,等.和厚朴酚对人神经胶质瘤U87细胞的体内外抗肿瘤作用[J].遵义医学院学报,2016,39(5):459-463.

[10] Lima D B,Valente R C,Capella M A.Ouabain-induced alterations in ABCB1 of mesenteric lymph nodes and thymocytes of rats and mice[J].Oncol Lett,2016,12(6):5275-5280.

[11] Wu J,Li D,Du L,et al.Ouabain prevents pathological cardiac hypertrophy and heart failure through activation of phosphoinositide 3-kinase α in mouse[J].Cell Biosci,2015,5(1):64.

[12] Wang Y,Ye Q,Liu C,et al.Involvement of Na+/K+-ATPase in hydrogen peroxide-induced activation of the Src/ERK pathway in LLC-PK1 cells[J].Free Radic Biol Med,2014,71(6):415-426.

[13] Ono Y,Chiba S,Yano H,et al.Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B (GPNMB) promotes the progression of brain glioblastoma via Na+/K+-ATPase[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,481(1-2):7-12.

[14] Majmundar A J,Wong W J,Simon M C.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40(2):294-309.

[15] Li J,Xu Y,Jiao H,et al.Sumoylation of hypoxia inducible factor-1α and its significance in cancer[J].Sci China Life Sci,2014,57(7):657-664.

[16] Coudre C,Alani J,Ritchie W,et al.HIF-1α and rapamycin act as gerosuppressant in multiple myeloma cells upon genotoxic stress[J].Cell Cycle,2016,15(16):2174-2182.

[17] Lin F,de Gooijer M C,Hanekamp D,et al.PI3K-mTOR pathway inhibition exhibits efficacy against high-grade glioma in clinically relevant mouse models[J].Clin Cancer Res,2017,23(5):1286-1298.

[18] 李杰,徐忠伟,程世翔,等.哇巴因诱发人神经胶质瘤u251细胞凋亡的机制[J].武警后勤学院学报：医学版,2016,25(3):174-177.

[收稿2016-12-29;修回2017-01-11]

(编辑：王福军)

Effects of Ouabain on the growth of human glioma U87-MG cells and the expression of HIF-1α

YangXiaosa1,2,LiuDongying3,LiJie1,YiTailong1,TuYue1,2,ChengShixiang1,2

(1.Affiliated Hospital of Logistics University of PAP,Tianjin 300162,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair; Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of PAP,Tianjin 300162,China; 3.Tianjin People’s Armed Police Corps Detachment of Sixth Medical Team,Tianjin 300410,China)

Objective To explore the effects of Ouabain on the growth of human glioma U87-MG cells and the expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α).Methods U87-MG cells were treated with different concentrations of Ouabain (0.05,0.5,2.5,25 μmol/L) for 24 h.MTT assay and Western Blot were used to detect cell viability and survival rate and the protein expression of HIF-1α,respectively.Results Compared with the control group,the optical density value (OD490) and cell viability of U87-MG cells which were treated with different concentrations of Ouabain were significantly decreased (allP<0.01).Compared with the control group,0.05 μmol/L Ouabain up-regulated the protein expression of HIF-1α (1.27±0.05vs.1.00±0.05,P<0.05),while 2.5 and 25 μmol/L Ouabain significantly decreased the protein level of HIF-1α (0.28±0.04,0.20±0.03vs.1.00±0.05,bothP<0.01).Conclusion Ouabain with high dose could promote the apoptosis of human glioma U87-MG cells by down-regulating HIF-1α.

Ouabain; Human glioma U87-MG cells; hypoxia inducible factor-1α; apoptosis

国家自然科学基金资助项目(NO：31200809)；武警部队后勤科研项目(NO：WJHQ2012-20)；武警后勤学院中心实验室开放基金资助项目(NO：2015ZXKF09)。

涂悦，女，博士，主任医师，研究方向：神经危重症，E-mail:ytumail@vip.126.com。

R741.05

A

1000-2715(2017)01-0064-04