芪桂益脉灵对大鼠心肌缺血再灌注损伤基质金属蛋白酶9及c-Jun氨基末端蛋白激酶表达的影响※

赵 龙 张超越 徐京育

(黑龙江中医药大学2014级硕士研究生，黑龙江 哈尔滨 150040)

芪桂益脉灵对大鼠心肌缺血再灌注损伤基质金属蛋白酶9及c-Jun氨基末端蛋白激酶表达的影响※

赵 龙 张超越 徐京育△

(黑龙江中医药大学2014级硕士研究生，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的 观察芪桂益脉灵对大鼠心肌缺血再灌注损伤基质金属蛋白酶9(MMP-9)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)信号通路的影响。方法 将50只健康雄性SD大鼠随机分为空白组(N)、假手术组(Sham)、单纯缺血再灌注组(I/R)、芪桂益脉灵高剂量组(QGYMLH)、芪桂益脉灵低剂量组(QGYML)，每组10只，分别给予0.9%氯化钠注射液、芪桂益脉灵(高、低剂量)，连续灌服7 d，结扎冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死模型，腹主动脉采血，离心取上层血清，采用酶联免疫法检测MMP-9的表达；取心肌组织，用中性福尔马林固定，应用免疫组化法检测磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表达。结果 Sham组MMP-9、P-JNK表达水平与N组比较差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、QGYMLL组、QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平均高于N组(P<0.05)；QGYML组、QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平均低于I/R组(P<0.05)；QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平低于QGYMLL组(P<0.05)。结论 芪桂益脉灵对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用，其机制与抑制心肌组织中JNK磷酸化程度及MMP-9表达有关，且与中药剂量相关。

黄芪；桂枝；心肌再灌注损伤；大鼠；JNK丝裂原活化蛋白激酶类；基质金属蛋白酶类

近年来，心肌梗死(以下简称心梗)的发病率不断上升，心梗再通后造成的心肌损伤成为关注的热点，所以心肌缺血再灌注治疗药物的研究具有重要意义。缺血再灌注的病理机制主要有炎性反应、能量代谢障碍等，其中c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)是炎性损伤的关键靶点[1-3]。JNK信号通路不仅在缺血期可被激活，在再灌注阶段也可被激活，参与炎性反应，进一步引起炎性损伤[4]。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶(MMPs)家族的主要成员之一，能在缺血再灌注损伤后使小血管壁受伤，导致细胞水肿及炎性浸润，早期抑制MMP-9表达，可以减轻梗死面积[5]。现有研究发现，激活JNK信号通路可以上调MMP-9表达。本研究通过芪桂益脉灵对大鼠进行预处理，观察心肌急性缺血再灌注损伤大鼠模型MMP-9和JNK的表达，研究芪桂益脉灵对缺血再灌注损伤保护机制[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠50只,体质量200 g～250 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(黑)2013-004]。

1.1.2 试剂 大鼠MMP-9酶联免疫分析试剂盒，购自北京诚林生物科技有限公司； SC-572(兔一抗)试剂盒、SC-6254(鼠一抗)试剂盒、PV-9001(兔二抗)试剂、PV-9002(鼠二抗)试剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；乌拉坦，购自北京博士德生物工程有限公司；3′3-二氨基苯联胺(DAB)显色溶液，购自上海杰美基因医药科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，购自上海易利生物科技有限公司；中药复方芪桂益脉灵，药物组成：黄芪、桂枝、苦参、三七、黄连、龙齿、党参、麦冬、五味子、炒酸枣仁，为免煎颗粒剂，购自江阴天江药业有限公司。

1.1.3 仪器 ECG-1150型心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)；DH-150型动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器有限公司)；DT5000A型电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；318型洗板机(上海三科仪器有限公司)；DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；ELX808吸收光酶标仪(上海启步生物科技有限公司)；NiKon E200光学显微镜；低温冰箱(日本三洋公司)；低温离心机(日本三洋公司)；冰冻切片机。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 健康SD大鼠50只，随机分为5组，分别为：空白组(N)、假手术组(Sham)、单纯缺血再灌注组(I/R)、芪桂益脉灵低剂量组(QGYMLL)、芪桂益脉灵高剂量组(QGYMLH)。每组10只，最终随机每组入组8只,相同条件下进行饲养。

1.2.2 给药 5组大鼠分别按照下列给药方法用药7 d。每日清晨N组、Sham组、I/R组均予空腹灌服0.9%氯化钠注射液2 mL、QGYMLL组空腹灌服低剂量芪桂益脉灵(0.6 g/kg)2 mL、QGYMLH组空腹灌服高剂量芪桂益脉灵(1.2 g/kg) 2 mL。

1.2.3 造模 按上述末次给药60 min后进行造模。大鼠用20%乌拉坦(1 g/kg)腹腔麻醉。麻醉后进行心电监测，气管切开，连呼吸机(呼吸频率为90次/min，潮气量为12 mL，呼吸比为1∶1)。于胸骨左缘3、4肋间，切开皮肤，长度约2 cm，逐层分离皮下组织和肌肉，打开胸腔及心包膜,挤出心脏；在肺动脉圆锥与左心耳交界处结扎左冠状动脉前降支，将结扎后的心脏放回胸腔内。连续记录冠状动脉结扎前后及再通后Ⅱ导联心电图。N组：只开胸，不穿线，不结扎；Sham组：开胸，只穿线但不结扎；I/R组行左主冠状动脉结扎60 min，再灌注180 min；QGYMLH组、QGYMLL组方法同I/R组。模型成功标准:心电示S-T段呈近似单线曲线拱背向上抬高;并见再灌注后心律失常。

1.3 观察指标及方法 (1)MMP-9：造模成功后，于腹主动脉采血5 mL，离心后取上层血清备用，按照MMP-9试剂盒检测方法检测大鼠MMP-9含量。(2)磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)：摘取大鼠心脏，剔除周围结缔组织，采用0.9%氯化钠注射液冲洗血液，用4%中性福尔马林固定备用，应用苏木精-伊红(HE)染色法观察心肌病理学变化；免疫组化法检测心肌组织中JNK信号通路表达，方法：①脱蜡、水化组织切片；②根据应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理；③3%H2O2去离水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；④PBS冲洗，2 min 3次；⑤滴加一抗试剂，室温孵育1～2 h，PBS冲洗，2 min 3次；⑥滴加Primary Antibody Enhancer(增强子),37 ℃孵育10～20 min，PBS冲洗，2 min 3次；⑦滴加二抗试剂,37 ℃孵育10～20 min，PBS冲洗，2 min 3次；⑧应用DAB溶液显色；⑨自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片，显微镜观察。在400倍显微镜下拍摄切片图像，每张图片选3个不重叠视野计算平均阳性百分比。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态学改变(HE染色) N组、Sham组肌纤维排列相对规则，细胞核呈椭圆形，间质未见明显异常；I/R组心肌组织细胞严重破坏，心肌细胞间质明显水肿、增宽，心肌纤维断裂溶解；QGYML组与I/R组相比有明显缓解，其中QGYMLH组改善更为明显。见图1。

图1 各组大鼠心肌病理学变化(HE×400)

2.2 各组大鼠P-JNK表达的免疫组化结果 N组、Sham组未见显著异常，肌纤维排列相对规则，细胞核椭圆形，间质未见明显异常；I/R组心肌组织细胞严重破坏，心肌细胞间质明显水肿、增宽，心肌纤维断裂溶解；QGYML组与I/R组相比，细胞间质水肿现象明显减轻，心肌纤维排列较为规则，其中QGYMLH组改善更为明显。见图2。

图2 各组大鼠P-JNK表达的免疫组化结果(×400)

2.3 各组大鼠MMP-9、P-JNK表达比较 见表1。

组 别nMMP-9(ng/L)P-JNK(%)N组833.07162±1.4319690.78±0.03Sham组835.32275±1.163989*1.00±0.02*I/R组844.16338±1.353010△2.13±0.13△QGYMLL组841.24712±0.687672△#1.23±0.11△#QGYMLH组838.54413±1.286125△#○1.12±0.08△#○

与N组比较，*P>0.05，△P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05；与QGYMLL组比较，○P<0.05

由表1可见，Sham组MMP-9、P-JNK表达水平与N组比较差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、QGYMLL组、QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平均高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)；QGYML组、QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平均低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)；QGYMLH组MMP-9、P-JNK表达水平低于QGYMLL组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

心肌的缺血再灌注损伤,尤其在急性心肌梗死通过经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗后, 可能出现一系列病情恶化现象，患者可能表现为严重心功能不全、严重心律失常、心功能衰竭、心源性休克、猝死等[7]。可进一步发生心室重构, 严重者会引起心力衰竭、心脏破裂等严重并发症，严重影响急性冠状动脉综合征的预后[8]。目前研究表明，心肌的缺血再灌注损伤与炎性介质密切相关。JNK家族是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成员之一，JNK信号通路可被多种因素激活，JNK的活化被认为其参与了细胞凋亡，其一旦被激活称为P-JNK，则会由细胞质转移到细胞核内，引起一系列作用底物的激活，与细胞凋亡密切相关[9]。JNK是一种具有多方面调节功能的蛋白激酶，在发生心肌缺血再灌注损伤时，JNK信号通路被激活，参与再灌注损伤时的炎性反应[10]。JNK蛋白激酶有3个基因编码，其表达广泛，在生理和病理过程中发挥重要作用[11]。MMPs是一组金属蛋白酶家族，常以酶原的形式存在，主要参与细胞外基质的微环境的稳定，目前MMPs已经被证实参与多种病理及生理过程[12]。近来研究发现MMPs快速参与缺血再灌注损伤等氧化应激反应, 同时有研究发现其抑制剂能有效抑制心肌缺血再灌注后损伤的发生[13]。MMP-9又被称为明胶酶B，是MMPs家族中的主要成员，目前研究发现血清中MMP-9浓度的增加与冠状动脉事件发生的危险程度呈正相关。心肌缺血再灌注后组织表达MMP-9是心肌小血管管壁损伤,从而导致细胞水肿及炎性细胞浸润的机制。在早期选择性抑制MMP-9可显著减轻心肌梗死面积[14]。

心肌缺血再灌注损伤属中医胸痹范畴，胸痹一名最早见于《内经》，属本虚标实，病机关键为心脉挛急和闭塞，气虚血瘀为该病的基本病机之一[15]。针对该病机，徐京育教授根据多年临床经验自拟中药复方芪桂益脉灵。方中黄芪补气升阳，益气补心,能通行血脉，为治疗气滞血瘀型胸痹心痛的要药；桂枝温通经脉，助阳化气；二者相互配伍，共为君药以补心气，通心脉。党参益气养血，助黄芪补气养心行气活血；三七活血止痛，化瘀养血，行血通脉；二者在补气的基础上，活血化瘀通脉，故为臣药。五味子、炒酸枣仁、龙齿养心阴，敛心气，麦冬滋阴为佐药。又恐全方滋补太过，故以苦参、黄连佐制，清心火、安神为使。此外桂枝、五味子、龙齿、三七、黄连等均入心经，作为引经药，引药入心。本方着重扶正气，助血运，提高机体抗缺血缺氧的能力。

本实验结果显示，缺血再灌注损伤后大鼠心肌组织中MMP-9和P-JNK表达明显高于N组和Sham组，说明心肌的急性缺血再灌注能够使炎症因子释放，JNK通路激活，也表明建模成功；芪桂益脉灵组MMP-9和P-JNK表达浓度明显低于I/R组(P<0.05)，表明芪桂益脉灵能够降低JNK的磷酸化水平，降低炎症因子MMP-9的释放，减轻心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡，对缺血心肌有保护作用；而QGYMLH组的MMP-9和P-JNK表达水平较QGYMLL组更低，说明高剂量组更能降低受损心肌，对其保护作用更佳。本研究不仅可以证实MMP-9和P-JNK的表达与心肌受损程度相关，还证明了芪桂益脉灵在心肌缺血再灌注损伤后对心肌具有一定的保护作用。

综上所述，芪桂益脉灵能够很好地减轻缺血再灌注心肌组织MMP-9炎症因子的释放及JNK信号通路激活造成的影响，改善缺血心肌病理性改变，也进一步证实了芪桂益脉灵在急性心肌缺血中具有保护作用，对新药的研究与开发提供了理论依据。

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(本文编辑：李珊珊)

Effects of Qigui-yimailing on the expression of matrix metalloproteinase-9 and c-Jun amino terminal protein kinasein in rats with myocardial ischemia reperfusion injury

ZHAOLong*,ZHANGChaoyue,XUJingyu.

*2014-GradeMasterofHeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Heilongjiang,Haerbin150040

Objective To observe the effects of Qigui-yimailing on the signal pathway of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and c-Jun amino terminal protein kinase (JNK) in rats with myocardial ischemia reperfusion injury. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into normal group (N), sham-operated group (Sham), pure ischemia reperfusion group (I/R), high dose of Qigui-yimailing group (QGYMLH) and low dose of Qigui-yimailing group (QGYMLL), 10 rats each group, rats in last three group were received 0.9% sodium chloride injection, high and low dose of Qigui-yimailing respectively, continuously treatment for 7 d. The acute myocardial infarction model was established by ligating the left anterior descending coronary arteries. The blood was collected from the abdominal aorta, the upper serum was taken by centrifugal, and the expression of MMP-9 was measured by ELISA. The expression of phosphorylation c-Jun amino terminal protein kinase (P-JNK) from formalin-fixed myocardial tissue was measured by means of immunohistochemical staining. Results There were no statistical differences on the expressions of MMP-9 and P-JNK between Sham and N group (P>0.05).The expressions of MMP-9 and P-JNK in I/R, QGYMLL and QGYMLH group were higher than N group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLL and QGYMLH group were lower than I/R group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLH group were lower than QGYMLL group (P<0.05). Conclusion Qigui-yimailing has protective effect of myocardial ischemia-reperfusion injury, and its mechanism may be related with the degree of JNK phosphorylation, the MMP-9 expression and the dosage of drug.

Huangqi; Guizhi; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Rats; JNK mitogen - activated protein kinases; Matrix metalloproteinases

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.02.026

※ 项目来源：2013年度黑龙江省自然科学基金面上项目(编号：H201326)

赵龙(1990—)，男，硕士研究生在读，学士。研究方向：心血管方向。

R285.5；R-33

A

1002-2619(2017)02-0264-05

2016-07-15)

△ 通讯作者：黑龙江中医药大学附属第一医院心血管病四科，黑龙江 哈尔滨 150040