超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母代谢的影响*

赵海锋 卢敏 周永婧 阳辉蓉 孟赫诚

(华南理工大学 食品科学与工程学院, 广东 广州 510640)

啤酒是一种低酒精度发酵酒,含有各种营养物质,成分均衡,适度饮用有益于健康[1- 2].传统的啤酒酿造是常浓酿造,现在的啤酒生产企业则主要采用高辅料酿造和高浓酿造技术[3].高浓酿造技术的应用可以降低生产成本、提高设备利用率,改善啤酒风味，但同时也会产生一系列的问题,例如高渗透压、高酒精毒性会使酵母的生长代谢受到影响,营养物质的缺乏(主要是氮源)会阻碍酵母的生长,使发酵延缓甚至停滞,从而影响啤酒发酵[4].而在提高酵母生长代谢和发酵效率的各种方法中,氮源补充被认为是最有效的方式.Vu等[5]发现添加0.25%的酵母抽提物和0.8%的吐温80可以缩短发酵时间和提高乙醇产量.Kitagawa等[6]证实了大豆肽的添加可以提高酵母的抗冻压力,使得酵母更能忍受低温环境,但是大豆肽影响酵母生长代谢的机制还不明确.Kemsawasd等[7]发现氮源对酵母生长代谢的影响是有菌株特异性的,不同酵母影响也不同.文中研究了超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物的水解度和添加量对酿酒酵母生长和发酵性能的影响,以期探讨酿酒酵母对小分子肽的吸收和代谢机制,并拓展小麦面筋蛋白的应用范围.

1 材料与方法

1.1 实验材料

酿酒酵母(Saccharomycespastorianus) FBY0095，华南理工大学食品生物技术研究室保藏;小麦面筋蛋白(蛋白含量76.1%)，安徽瑞福祥食品有限公司提供;胰酶(酶活力2.7×107U/g)，重庆市全新祥盛生物制药有限公司提供;大麦芽、60 °P高浓麦葡糖浆,广州珠江啤酒有限公司提供;其他试剂均为分析纯.

冷冻离心机,3-18K,德国Sigma公司出品;全自动糖化仪,杭州博日科技有限公司出品;高效液相色谱仪,Waters2695,美国Waters公司出品;低温培养箱,LRN-250CL,上海一恒科技有限公司出品;紫外分光光度计,UV-721,上海精密科学仪器仪表有限公司出品.

1.2 实验方法

小麦面筋蛋白水解物的制备:参照万春艳[8]制备大豆分离蛋白水解物的方法并加以改进,其中蛋白与水配比为1∶10(质量体积比(g/mL)),调pH至9.0,胰酶添加量为蛋白质量的1%.

麦汁制备、酵母活化和扩培:参照万春艳等[9- 11]的方法,使20 °P麦汁的游离氨基氮(FAN)的含量控制在180 mg/L.

酵母发酵:将不同酶解时间的水解物分别添加至麦芽汁培养基中作为实验组,不添加水解物的作为空白对照组(CK),调pH至5.5，高压灭菌后,按每升培养基6.8 g酵母泥接入扩培后的酵母,在12 ℃的培养箱发酵,厌氧,隔天摇瓶.

1.3 分析方法

1.3.1 水解度(DH)测定

参照王剑锋等[12- 14]的水解度测定方法测水解度.

1.3.2 酵母增殖和发酵性能指标测定

参照宗绪岩等[15- 16]的发酵过程各指标测定方法测量乙醇、表观发酵度、发酵液降糖、生物量等.

1.3.3 游离氨基氮的测定

采用茚三酮比色法,样液稀释100至200倍,在1、2号玻璃试管中加入2 mL的蒸馏水,2、4号试管中加入2 mL甘氨酸标准液,其余试管则加入稀释后的样液,然后各试管中加入1 mL的发色剂,加玻璃珠,盖上螺帽,将试管放于沸水浴中,精确反应16 min,在20 ℃的水浴中冷却20 min,再各加入稀释剂5 mL,充分混匀.用空白液管(1、2 号试管)调节分光光度计零点,于570 nm 下测定吸光值,尽量在30 min内测完.

FAN含量(mg/L)=样液吸光值×2(mg/L)×稀释倍数/甘氨酸标准液的吸光值

FAN含量消耗率(%)=(FAN初始量-FAN最终量)/FAN初始量×100%

称取0.107 2 g甘氨酸用水溶解,定容至100 mL,从中取1 mL用水稀释至100 mL,即为甘氨酸标准液,游离氨基酸质量浓度为2 g/L.

发色剂的制备：取10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4、0.5 g茚三酮、0.3 g果糖溶于 100 mL 去离子水.

稀释剂的制备：称取碘酸钾2 g溶于600 mL水中,加入96%(体积分数)乙醇400 mL.

1.3.4 小麦面筋蛋白水解物分子量分布的测定

高效液相色谱法,参照莫芬等[17]的方法测定.色谱柱：TSK gel 2000SXL凝胶柱，7.8 mm×300 mm；预柱：C18；柱温：30 ℃.流动相：100%磷酸盐缓冲液(pH 7.2);流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；洗脱时间：20 min.检测波长：214 nm.

1.3.5 数据处理

实验数据以3次平行实验的平均值作为最终结果，用Origin 8.0和Excel 软件数据作图处理,利用SPSS 17.0 软件对数据进行差异显著性检验分析，以P<0.05为差异显著.

2 结果与讨论

2.1 小麦面筋蛋白胰酶酶解过程中水解度的变化

小麦面筋蛋白可以被不同种类的蛋白酶酶解得到水解物,前期的研究发现[18],胰酶处理过的小麦面筋蛋白水解物具有良好的生理活性,所以文中选择胰酶水解小麦面筋蛋白.酶解过程中水解度的变化如图1所示.酶解的36 h内,水解度在6.8%～22.4%之间变化.前24 h随着时间的增加水解度不断增大,在24 h时水解度达到了22.4%,但是在24～36 h间水解度基本趋于稳定,酶解36 h时水解度为21.7%.随着反应的进行底物浓度变小,可以被胰酶水解的肽键数目逐渐减少,同时酶活力也逐渐下降,因此随着时间的延长,在24～36 h之间水解度并无显著变化.

不同字母表示数据间存在显著性差异

Fig.1 Changes in degree of hydrolysis of wheat gluten protein treated by pancreatic enzymes

不同水解度的酶解液中肽的分子量分布也不同,结果如表1所示.随着水解度的增大,各水解物中10 ku的大分子肽类物质逐渐减少,被水解成小分子肽或氨基酸,3 ku以下的多肽则逐渐增加,所占比例最多,从最初的32.8%到最终的62.7%.水解度为22.4%的酶解液中小分子肽最多,而酶解至36 h时,水解度和小分子肽含量均未进一步增大和提高.

表1 不同DH的水解物中肽的分子量分布

Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates with different DH

水解物编号DH/%基于分子量的肽的分布/%>10ku5～10ku3～5ku<3kuWG26.7923.7621.4022.0232.82WG49.0411.4218.8225.0844.68WG812.326.1315.7626.7551.36WG1215.744.3513.8926.8754.89WG2422.451.749.4826.0762.71WG3621.731.869.8126.0262.31

2.2 不同水解度的小麦面筋蛋白水解物对酵母生长的影响

将不同水解度的酶解物以1%的量添加到20 °P的超高浓麦汁中进行酵母发酵,观察其对酵母生长和活性的影响,结果见图2.水解度在6.8%～22.4%之间时,随着水解度的增大,酵母净增长量也增大,水解度22.4%组的酵母细胞净增长量为6.0 g/L,达到最大值,说明酶解物的促酵母生长作用与其水解度有一定的相关性.发酵结束后,发酵液中酵母活性均保持在85%以上,其中WG24组的酵母活性明显高于其他组,达到94.8%.

不同字母表示数据间存在显著性差异

图2 不同DH的小麦面筋蛋白水解物对酵母增殖和活性的影响

Fig.2 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different DH on the proliferation and viability of brewer’s yeast

小麦面筋蛋白水解后的主要物质是肽类物质,而肽类物质的生理活性与其分子量的大小有关.小麦面筋蛋白水解物中3 ku以下的多肽所占比例最多,说明对促进酵母生长起主导作用的是小分子肽,与以往研究得出的结论一致.已有研究证实了有生理活性的主要是小分子肽,Zhao等[19]发现3 ku以下的大豆肽能显著促进酵母细胞的生长与代谢.张清丽[20]发现3 ku以下的酪蛋白活性肽对乳酸菌的生长代谢及乳酸发酵有很好的促进作用.以上结果说明，水解度为22.4%的小麦面筋蛋白酶解物的促酵母生长效果最好,因此最佳的酶解时间为24 h.

2.3 小麦面筋蛋白水解物(WG24)添加量对酵母生长代谢的影响

将酶解24 h得到的小麦面筋蛋白水解物以不同的量添加至培养基中，观察酵母的生长代谢.从图3中的生物量曲线图可以看出,酵母生长经过了延滞期和对数期后第8天生物量达到最大,经过了两天的稳定期后进入了衰亡期,细胞逐渐自溶,生物量降低.在第23天时最大生物量的WG1.0%组为6.4 g/L,对照组生物量最少为5.5 g/L,4组样的最大净增长量与最大生物量结果一致,均为WG1.0%组>WG2.0%组>WG0.1%组>对照组,相比之下,添加1.0%的水解物对酵母的促生长效果最好.这印证了上面的实验结果,即水解物的添加可以促进酵母生长,但是其促进作用并不总随着水解物添加量的增大而增加,过多的水解物在一定程度上会抑制酵母细胞的生长,抑制原因尚待进一步探究.

图3 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母增殖的影响

Fig.3 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different amounts on proliferation of brewer’s yeast

2.4 小麦面筋蛋白水解物添加量对酵母发酵性能的影响

游离氨基氮(FAN)是麦汁中能够被酵母直接利用的含氮物质,主要是游离氨基酸和铵离子以及小分子肽(二肽和三肽),酵母的生长代谢伴随着氮源的吸收利用[21].从图4可知,20 °P的超高浓麦汁最初FAN含量是180 mg/L左右,添加不同量的小麦面筋蛋白水解物(WG24)后,FAN含量均有不同程度提高,WG0.1%组的最初FAN是200 mg/L,而WG1.0%和WG2.0%组的FAN含量分别是390和580 mg/L,充足的氮源可以保证酵母细胞的快速生长,从而有利于啤酒的发酵.在发酵前12 d,酵母细胞大量生长繁殖,伴随着氮源物质的大量消耗,而前2 d的FAN下降速度相对较快,12 d之后,FAN含量又有小幅度的上升,然后趋于平稳.这是因为随着发酵的进行,在后期由于乙醇的大量产生和其他产物的积累,对细胞产生了毒害作用,从而使其自溶,胞内的氮类物质进入发酵液中,FAN含量小幅地上升[22].发酵结束后,各组残留FAN含量不同,并不是所有的氮源都能被吸收利用,有些多肽类氮源要用于稳定啤酒的泡沫和多肽类复杂物质的代谢合成[23].各组的FAN利用率分别是71%、60%、47%和41%,说明初始FAN含量越低,利用量越少,但是利用率却越高.WG1.0%组添加了水解物后FAN含量比对照组增加了200 mg/L,结束时FAN消耗比对照组多50 mg/L,说明水解物在高浓麦汁中能被酵母有效的利用25%,WG2.0%组也有同样的结果.

图4 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母发酵利用FAN的影响

Fig.4 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on FAN utilization rate of brewer’s yeast

在酿酒酵母生长代谢的过程中不仅有氮源物质的消耗吸收,同时也伴随着糖的吸收利用,如图5所示.在20 °P的超高浓麦汁发酵中,4组最初的糖度基本一致,随着酵母的生长繁殖,营养物质被消耗,在前4天,4组的降糖速率差距不大,而从第4天到第12天之间,各自的耗糖速度出现差异,WG2.0%组最慢,发酵12天之后,酵母停止生长,糖度基本保持稳定.此时,WG1.0%组的表观发酵度达到了84%,WG0.1%组的发酵度则是82%左右,对照组也发酵结束,达到了80%,但是WG2.0%组却只有76%,氮源的充足可以使酵母快速生长繁殖,大量消耗营养物质,但是过量的氮源在某种程度上又会抑制酵母的生长,所以氮源的适量补充是很有必要的.

图5 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母降糖的影响

Fig.5 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on sugar consumption of brewer’s yeast

酵母细胞吸收氮源和糖类以及其他营养物质的过程中,一部分用于自身的繁殖,另一部分则用于乙醇以及其他高级醇和酯类等风味物质的合成.发酵过程中的乙醇含量如图6所示,在酵母生长的前12 d内,乙醇含量逐渐增加,之后发酵结束,乙醇含量保持恒定.在乙醇生成的整个过程中,WG1.0%组的乙

图6 小麦面筋蛋白水解物的添加量对酿酒酵母乙醇生成的影响

Fig.6 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on ethanol yield of brewer’s yeast

醇含量始终是4组中最高的,达7.6%之多,比乙醇含量最少的对照组提高了15%,而WG0.1%和WG2.0%组的乙醇含量相对于对照组也有一定的提高.综合以上结果,可以得出小麦面筋蛋白水解物的最适添加量为1.0%(见表3).这进一步说明了小麦蛋白水解物在超高浓度麦汁中能够有效促进酿酒酵母的生长和发酵,是啤酒酿造的一种有效氮源.

表3 添加1.0%的小麦蛋白水解物对酿酒酵母发酵性能的影响

Table 3 Effects of 1.0% wheat gluten hydrolysates on fermentation performance of brewer’s yeast

项目发酵周期/d净增长量/(g·L-1)表观发酵度/%终残糖/°PFAN利用量/(mg·L-1)乙醇产量/%对照组125.81803.72131.06.6WG1.0%126.08843.02185.07.6变化率/%04.6523.2041.215.2

3 结语

小麦面筋蛋白水解物在20 °P的超高浓麦汁中对酿酒酵母的增殖、活性保持以及发酵代谢具有促进作用,在啤酒发酵中可作为酵母的有效氮源.胰酶处理小麦面筋蛋白时,其中水解度达22.4%的水解物添加量为1.0%时对酵母的促进效果最佳,可使酵母活性达94.8%,残糖量降低23.2%,乙醇产量提高15.2%.文中的研究明确了小麦面筋蛋白水解物对于提高酵母生长和发酵性能的作用,在啤酒生产中有潜在的应用价值和指导意义.

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