Latexin对耐吉西他滨胰腺癌细胞化疗改善作用及其可能机制的体外研究

郑继行 王成 周香 薛战雄 蔡振寨

·论著·

Latexin对耐吉西他滨胰腺癌细胞化疗改善作用及其可能机制的体外研究

郑继行 王成 周香 薛战雄 蔡振寨

目的 观察Latexin干预对耐吉西他滨胰腺癌SW1990细胞耐药性的影响，探讨其可能机制。方法 采用吉西他滨药物浓度梯度递增诱导法建立吉西他滨耐药SW1990细胞株(SW1990/GZ)。采用CCK-8法检测吉西他滨对SW1990、SW1990/GZ细胞的IC50，并检测10、20、40 ng/μl Latexin干预细胞48 h后的IC50，计算耐药指数(RI)。采用定量RT-PCR 法、蛋白质印迹法检测SW1990、SW1990/GZ细胞Latexin基因mRNA和蛋白的表达，检测40 ng/μl Latexin干预48 h后SW1990、SW1990/GZ细胞Shh、Gli1的mRNA和蛋白表达。结果 成功建立了SW1990/GZ细胞株，它在含150 μmol/L吉西他滨的培养液中稳定生长、传代。 吉西他滨对SW1990、SW1990/GZ细胞的IC50值分别为(3.8±0.4)μmol/L和(226.5±13.6)μmol/L，SW1990/GZ细胞显著高于SW1990细胞，差异有统计学意义(P=0.000)；RI均值为59.6。10、20 、40 ng/μl Latexin干预48 h后，吉西他滨对SW1990细胞IC50值分别为(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，对SW1990/GZ细胞的IC50值分别为(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，除10 ng/μl Latexin干预的SW1990细胞外，其余剂量Latexin干预的SW1990、SW1990/GZ细胞IC50值均较未干预细胞显著下降，差异具有统计学意义(P值均<0.05)；RI均值分别为37.7、28.1、23.1。SW1990、SW1990/GZ细胞Latexin的mRNA相对表达量分别为0.85±0.08、0.31±0.07， 蛋白相对表达量分别为0.49±0.09、0.13±0.05，SW1990/GZ细胞的表达量显著低于SW1990细胞，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。40 ng/μl Latexin干预48 h后，SW1990/GZ细胞Shh mRNA表达量从未干预细胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA表达量从0.58±0.06下降至0.35±0.05；Shh蛋白表达量从0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表达量从0.78±0.08下降至0.28±0.03，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论 Latexin能增强耐吉西他滨胰腺癌SW1990细胞对吉西他滨的敏感性，其机制可能与抑制SHH通路的激活有关。

胰腺肿瘤； Latexin； 抗药性，肿瘤； 药物疗法； 吉西他滨； 信号传导

Fund program：Project received research funding from Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(Y2100546)

胰腺癌是严重威胁人类健康的消化系统常见恶性肿瘤，早期诊断困难，发现时往往已失去根治手术机会。化疗是晚期胰腺癌的主要治疗方法，但胰腺癌化疗敏感性低，易耐药，因此寻求改善胰腺癌耐药的药物及探索其可能机制具有重要意义。Sonic Hedgehog(SHH)是一条高度保守的信号转导通路，在胰腺癌发生和发展及耐药机制中发挥重要作用，同时还能影响细胞凋亡相关信号通路。Latexin作为内源性羧肽酶抑制剂，是胰腺癌潜在的肿瘤抑制剂[1]。本课题组之前的研究发现，Latexin在胰腺癌组织中的表达显著下降，通过基因转染使Latexin过表达及给予外源性Latexin蛋白均能抑制胰腺癌干细胞样细胞的增殖[1-3]。本研究进一步建立耐吉西他滨胰腺癌细胞株,通过外源性Latexin干预，观察其对化疗的改善作用及其可能的相关机制。

材料与方法

一、吉西他滨耐药细胞株的建立

人胰腺癌细胞株SW1990购自中科院上海生命科学研究院，常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及链霉素的RPMI-1640培养液。收集对数生长期细胞，以5×105/ml细胞密度接种于培养瓶，采用吉西他滨药物浓度梯度递增诱导法建立吉西他滨耐药细胞株(SW1990/GZ)。先以3 μmol/L吉西他滨诱导培养3 d，去除死亡细胞，更换培养液后继续培养3 d，待细胞稳定达到对数生长期，继续传代。根据细胞生长状态递增吉西他滨浓度为6、12、24、48、70、90、110、130、150、170 μmol/L。诱导约8个月，确定细胞能够稳定存活并能够连续传代的最高吉西他滨浓度，以获得SW1990/GZ。进行下述实验前脱药培养细胞4周。

二、CCK-8法检测吉西他滨的IC50值

取对数生长期的SW1990、SW1990/GZ细胞，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，SW1990细胞分别加入0.1、0.5、2.5、5.0、10 μmol/L吉西他滨，SW1990/GZ细胞分别加入10、50、100、200、400 μmol/L吉西他滨，每个浓度设5个复孔，以未加药物孔作为对照。常规培养48 h后吸弃上清，更换培养液，每孔加入10 μl CCK-8，继续培养4 h后，置酶联免疫检测仪上检测各孔450 nm波长的吸光度值(A450值)。应用graphpad prism 5软件获取IC50值，计算耐药指数(resistance index，RI)。RI=SW1990/GZ细胞IC50值/SW1990细胞IC50值。

取对数生长期SW1990、SW1990/GZ细胞，以每孔1×104个细胞接种96孔板，加入10、20、40 ng/μl Latexin干预培养48 h，采用上述同样方法检测吉西他滨的IC50值。

三、蛋白质印迹法检测细胞Latexin、Shh、Gli1蛋白表达

取对数生长期SW1990、SW1990/GZ细胞，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，培养48 h后收集细胞，采用预冷裂解液提取细胞总蛋白，蛋白定量后行蛋白质印迹法检测细胞Latexin蛋白表达，以β-actin为内参。兔抗人Latexin多克隆抗体(Abcam公司)工作浓度1∶1 000。最后ECL发光，X线曝光、显影、定影。

取对数生长期SW1990、SW1990/GZ细胞，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，加入40 ng/μl Latexin干预培养48 h，同上述方法检测Shh、Gli1蛋白表达。兔抗人Shh、Gli1多克隆抗体(Cell Signalling Technology公司)工作浓度均为1∶1 000。

利用Design-Expert8.0Trial数据处理软件中ANOVA程序对表3的试验结果进行二次回归分析，计算出方程各项系数并进行方差分析，可得2个因子与Y之间的回归方程：Y=99.21+2.22A-1.45B+0.95AB-1.22A2-1.12B2。

应用AlphaEaseFC4.0图像分析软件检测各条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

四、定量RT-PCR 法检测细胞Lacexin、Shh、Gli1 mRNA表达

收集上述各组细胞，采用Trizol提取细胞总RNA，于紫外分光光度仪检测RNA纯度及浓度，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR®Premix Ex Taq(Perfect Real Time)荧光实时定量PCR试剂盒(日本Takara公司)在Roche Light Cycle480荧光定量PCR仪上进行扩增。引物序列：Latexin上游引物5′-GAAGGTCAAACAAGCCAGCAT-3′，下游引物5′-AACCCAGGCTAAATGTAGAACG-3′；Shh上游引物5′-AGGCTGATGACTCAGAGGTGT-3′，下游引物：5′-GCCCTCGTAGTGCAGAGACT-3′；Gli1上游引物5′-TTCCTACCAGAGTCCCAAGT-3′，下游引物5′-CCCTATGTGAAGCCCTATTT-3′；内参β-actin上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物：5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s，45个循环。确认qRT-PCR扩增曲线和融解曲线，通过仪器自带软件获取Ct值，采用公式2-△△Ct计算mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

五、统计学处理

结 果

一、吉西他滨的IC50值

二、Latexin mRNA及蛋白表达的变化

SW1990、SW1990/GZ细胞Latexin mRNA相对表达量分别为0.85±0.08、0.31±0.07，蛋白相对表达量分别为0.49±0.09、0.13±0.05 ，SW1990/GZ细胞的表达量显著低于SW1990细胞，差异有统计学意义(t=8.80，P=0.001；t=6.06，P=0.004；图1)。

图1 Latexin蛋白在SW1990(1)、SW1990/GZ(2)细胞中的表达

三、Latexin干预后吉西他滨IC50值的变化

应用10 、20、40 ng/μl Latexin干预48 h后，吉西他滨对SW1990细胞的IC50值分别为(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，除10 ng/μl外，其余剂量干预组显著低于未干预的SW1990细胞，差异有统计学意义(t值分别为2.45、4.50、6.93，P值分别为0.070、0.011、0.002)；吉西他滨对SW1990/GZ的IC50值分别为(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，均显著低于未干预的SW1990/GZ细胞，差异具有统计学意义(t值分别为13.55、19.61、23.20，P值均为0.000)。RI均值分别为37.7、28.1、23.1。

四、Latexin干预后细胞Shh、Gli1 mRNA及蛋白表达的变化

应用40 ng/μl Latexin干预48 h后，SW1990细胞Shh mRNA表达量从未干预细胞的0.56±0.06下降至0.37±0.05，Gli1 mRNA从未干预细胞的0.41±0.05下降至0.30±0.04，差异均有统计学意义(t=4.21，P=0.014；t=2.98，P=0.041)；Shh蛋白表达量从0.34±0.04下降至0.14±0.03，Gli1蛋白表达量从0.43±0.04下降至0.19±0.03，差异均有统计学意义(t=6.93，P=0.001；t=9.98，P=0.001；图2)。

图2 Latexin干预前(1)及干预后(2)SW1990细胞Shh、Gli1蛋白表达

应用40 ng/μl Latexin干预48 h后，SW1990/GZ细胞Shh mRNA表达量从未干预细胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA从未干预细胞的0.58±0.06下降至0.35±0.05，差异均有统计学意义(t=5.77，P=0.004；t=5.10，P=0.007)；Shh蛋白表达量从0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表达量从0.78±0.08下降至0.28±0.03，差异均有统计学意义(t=5.93，P=0.004；t=10.13，P=0.001；图3)。

讨 论

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其手术切除率不足20%[4]，化疗仍然是胰腺癌的重要治疗方法。吉西他滨是一种新型人工合成嘧啶核苷类似物，吉西他滨单药或者联合其他抗肿瘤药物是治疗胰腺癌的首选化疗方案，但其治疗效果有限，无法显著延长患者的生存时间[5]，对吉西他滨等化疗药物产生耐药性是化疗失败的主要原因。因此，改善胰腺癌化疗耐药，探索其可能机制意义重大。

图3 Latexin干预前(1)及干预后(2)SW1990/GZ细胞Shh、Gli1蛋白的表达

Latexin是哺乳类羧肽酶的内源性抑制物，它与潜在的肿瘤抑制因子他扎罗汀诱导基因(TIG)1具有广泛的同源性[6]，可非竞争性、不可逆地抑制羧肽酶活性，通过调控细胞间信号通路及调节蛋白聚集等方式独立或协同其他分子调节细胞增殖与凋亡[7]。越来越多的研究表明，Latexin在多种肿瘤中表达下调，并抑制肿瘤的生长。本研究采用药物浓度梯度递增诱导法建立吉西他滨耐药细胞株，结果显示Latexin在吉西他滨耐药的SW1990细胞中表达下降，经过Latexin干预后可降低耐药细胞株的耐药指数，提示其能改善化疗的治疗效果。

SHH是一条高度保守的信号转导通路，由糖蛋白配体(Hh)、跨膜蛋白受体(Ptch,Smo)及下游转录因子Gli家族等组成，其在胰腺癌发生、发展及耐药中发挥重要作用[8]。激活SHH通路中的Gli2基因能诱导未分化的胰腺肿瘤，通过环靶明或其他方式阻断SHH通路能够诱导肿瘤细胞凋亡[9-10]。在胰腺癌的化疗治疗模型中，抑制SHH通路能增加个体对化疗药物的敏感性[11]。因此，阻断SHH信号通路有望成为逆转肿瘤耐药的重要靶点[12]。本研究结果显示，Latexin干预SW1990/GZ细胞后Shh、Gli1 mRNA及蛋白的表达明显被抑制，提示Latexin可能通过抑制SHH通路的激活而抑制胰腺癌细胞增殖，从而改善对吉西他滨的化疗耐药性。

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(本文编辑：冀凯宏)

In vitro study on the improvements of Latexin on the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells and potential mechanism

ZhengJihang,WangCheng,ZhouXiang,XueZhanxiong,CaiZhenzhai.

DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

CaiZhenzhai,Email:czz77@sina.com

Objective To observe the effect of Latexin treatment on the chemoresistance in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990, and explore the potential mechanism. Methods Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was induced and established by increasing gemcitabine dosage intermittently. IC50of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells pre and post Latexin treatment at the dosage of 10, 20 and 40 ng/μl for 48 h was evaluated using CCK-8 assay. The mRNA and protein expression of Latexin gene in SW1990 and SW1990/GZ cells were evaluated using qRT-PCR and h. Results A gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was obtained successfully, which can grow stably and passage in the media containing 150 μmol/L gemcitabine. The IC50 values of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells were (3.8±0.4)μmol/L and(226.52±13.61)μmol/L, respectively, and the later was greatly higher than the former, which was statistically different (P=0.000). The drug resistance indexes (RI) was 59.6. After treated with different concentrations of Latexin(10，20，40 ng/μl), the IC50of SW1990 cells was (3.0±0.4)μmol/L, (2.5±0.3)μmol/L and (1.8±0.3)μmol/L, respectively，and the IC50of SW1990/GZ cells was(113.08±5.01)μmol/L,(70.26±2.31)μmol/L and (42.12±1.31)μmol/L, respectively. Compared with the untreated cells，the IC50of gemcitabine in 20，40 ng/μl Latexin treated cells was obviously decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Compared with the SW1990 cells，the expression of Latexin in SW1990/GZ cells was obviously decreased. RI were 37.7, 28.1 and 23.1，respectively. mRNA relative expression of Latexin in SW1990 and SW1990/GZ cells were 0.85±0.08 and 0.31±0.07, and protein relative expression were 0.49±0.09 and 0.13±0.05, and Latexin expression in SW1990/GZ was obviously lower than that in SW1990 cells and the difference was statistically significant (P<0.05). After being treated by 40 ng/μl Latexin, SHH mRNA in SW1990/GZ cells decreased from 0.89±0.09 (control cells) to 0.53±0.06, Gli1 mRNA decreased from 0.58±0.06 to 0.35±0.05, Shh protein decreased from 0.72±0.09 to 0.35±0.06，Gli1 protein level decreased from 0.78±0.08 to 0.28±0.03, and all the differences were statistically significant (P<0.05 or 0.01). Conclusions Latexin can significantly improve the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells, and the potential mechanism may be related to the inhibition of sonic hedgehog pathway activation.

Pancreatic neoplasms； Latexin； Drug resistance neoplasm； Drug therapy; Gemcitabine; Signal tvansduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.009

325000 浙江温州，温州医科大学附属第二医院普外科(郑继行、周香)，消化内科(薛战雄、蔡振寨)；宁波市第一医院普外科(王成)

蔡振寨，Email: czz77@sina.com

浙江省自然科学基金(Y2100546)

2016-10-13)