人脂肪间充质干细胞对急性坏死性胰腺炎大鼠治疗疗效的观察

庄培涛 谭雪莹 邱建涛 葛倩 邢雪 类成刚

·论著·

人脂肪间充质干细胞对急性坏死性胰腺炎大鼠治疗疗效的观察

庄培涛 谭雪莹 邱建涛 葛倩 邢雪 类成刚

目的 观察人脂肪间充质干细胞(hADMSCs)对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织修复及炎症反应的影响，探讨其可能机制。方法 分离、纯化hADMSCs，流式细胞仪检测hADMSCs表面标志物CD90、CD29、CD34、CD45。将80只体重170～210 g SD雄性大鼠按完全随机法分为4组，对照组8只，其余每组24只。对照组不做任何处理；假手术组行开腹翻动肠壁后关腹；ANP组采用开腹后牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射法制模；hADMSCs组在制模后12 h将DAPI标记的hADMSCs通过尾静脉注射入大鼠体内。观察各组12、24、48 h大鼠的存活情况、胰腺的大体形态及病理变化，检测血清淀粉酶活性及TNF-α、IL-6、IL-10水平；观察hADMSCs在大鼠胰腺、肝脏、肺组织中的分布情况。结果 对照组与假手术组大鼠全部存活，ANP组大鼠术后24、48 h分别死亡5、11只。hADMSCs组术后48 h死亡12只，与ANP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。hADMSCs组术后胰腺病理损伤程度较ANP组减轻。hADMSCs组术后12、24、48 h的淀粉酶活性分别为(999±110)、 (1831±110)、(3991±130)U/L，TNF-α水平为(62.40±2.35)、(80.51±4.51)、(93.46±6.60)ng/L，IL-6水平为(60.46±7.34)、(80.61±8.40)、(100.58±9.49)ng/L，较ANP组的(2 402±146)、(3 292±137)、(5 632±112)U/L，(87.13±3.39)、(105.41±10.06)、(114.57±3.06)ng/L，(70.67±10.90)、(107.61±10.53)、(145.34±10.48)ng/L均显著降低，差异具有统计学意义(P值均<0.05)；IL-10水平为(56.63±6.35)、(80.38±5.71)、(100.26±6.51)ng/L，较ANP组(45.26±8.04)、(68.25±8.42)、(81.32±5.96)ng/L均显著升高，差异具有统计学意义(P值均<0.05)。hADMSCs可迁移到胰腺、肝脏、肺脏等受损组织内，以胰腺组织内数量最多，肺组织次之，肝脏组织最少。结论 hADMSCs参与胰腺组织损伤的修复，其机制可能与抑制TNF-α、IL-6分泌，增加IL-10分泌，从而减轻炎症反应有关。

胰腺炎，急性坏死性； 间质干细胞； 干细胞移植； 大鼠

Fund program：Project supported by Qingdao science and Technology Commission[12-1-4-16-(5)-jch]

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于组织和器官的有多向分化潜能的成体干细胞，具有免疫调节、炎症趋化、组织修复功能及低免疫原性等生物学特性，在组织修复与免疫调节中发挥重要作用[1-3]。目前，人们已成功地将MSCs从骨髓、胎盘、脂肪、脐带血、肝脏等组织器官中培养出来。有研究证实MSCs可以减轻急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠的胰腺组织病理损伤、降低血清炎性因子及酶学指标的水平[4]。脂肪MSCs取材方便，来源丰富，可在体外稳定增殖传代，在一定诱导条件下可以定向分化为中胚层及内、外胚层组织细胞[5]。本研究用人脂肪来源的MSCs(human adipose mesenchymal stem cells, hADMSCs)治疗ANP大鼠，观察其对ANP大鼠胰腺病理损伤及炎症反应的影响，探讨其作用机制。

材料与方法

一、hADMSCs的分离、培养和鉴定

90只健康清洁级SD大鼠[合格证号sckl(鲁)20140007]购于青岛市大任富成畜牧有限公司，鼠龄8～10周，体重170～210 g，在恒定温度(22±2)℃和室内湿度(55±4)%环境下适应性饲养1周，标准饮食、自由饮水。

无菌条件下获取人脂肪生理盐水混合物50 ml，离心、PBS清洗2遍去除血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒，用0.075%Ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床消化60 min，1 500 r/min离心10 min，弃上层未消化的脂肪组织及油脂，重悬沉淀后用200目筛网过滤，再次离心，用红细胞裂解液裂解红细胞5 min、PBS洗涤2遍，10%胎牛血清高糖DMEM重悬，以(1～5)×104/cm2密度接种至10 cm2培养板中。以第1次接种的细胞为0代，记作P0代，待细胞90%融合后使用0.25%胰酶消化，以1∶3比例接种传代。取第3代(P3代)hADMSCs，采用流式细胞技术检测hADMSCs表面标志物CD34、CD90、CD29、CD45的表达进行鉴定。

二、hADMSCs的DAPI标记

取对数生长期hADMSCs，PBS洗涤细胞2次，无菌条件下加入DAPI工作液，置于细胞培养箱10 min。弃DAPI工作液，PBS洗去未与细胞核结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞标记情况，用含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养。

三、动物模型建立及分组

将80只SD大鼠按完全随机法分为4组。对照组8只，其余每组24只。对照组不做任何处理；假手术组行开腹翻动肠壁后关腹；ANP组开腹后采用牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射方法制模；hADMSCs组在制模后12 h将DAPI标记的hADMSCs悬液(5×106个)通过尾静脉注射入大鼠体内。除对照组外，其他各组大鼠于术后12、24、48 h记录大鼠的存活情况，至脱颈处死取材。

四、大鼠胰腺组织病理学检测

取大鼠胰腺组织，以4%多聚甲醛4℃固定30 min，行HE染色，观察病理学改变。

五、大鼠血清淀粉酶及TNF-α、IL-6、IL-10测定

按照试剂盒说明书检测各组大鼠血清淀粉酶活性及TNF-α、IL-6、IL-10水平。

六、hADMSCs在胰腺、肝脏、肺中的分布

脱颈处死大鼠后快速取得胰腺、肝脏、肺等标本，-80℃冰箱避光冻存，2 h内制作冷冻切片，荧光显微镜下观察DAPI标记的hADMSCs在各器官中的分布情况。

七、统计学处理

结 果

一、各组大鼠生存情况

对照组与假手术组大鼠全部存活。ANP组大鼠术后24、48 h分别死亡5只和11只。hADMSCs组术后48 h死亡12只，与ANP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

二、hADMSCs的培养与鉴定

人脂肪细胞P0代接种24 h可见少量细胞贴壁，5 d后可见多处细胞集落形成；10 d左右细胞达80%融合；P3代细胞维持成纤维细胞样形态，呈放射状生长，3 d即可达80%融合。流式细胞仪检测CD90、CD29均阳性，CD34、CD45均阴性(图1)。

图1 P3代hADMSCs表面标志物CD90、CD29、CD34、CD45的表达(流式细胞仪)

三、胰腺组织病理学改变

对照组与假手术组大鼠胰腺无明显病理学改变，镜下见胰腺组织结构清晰，腺泡小叶结构完整，间质无渗出。ANP组术后12 h胰腺水肿、坏死，并出现渗出液，镜下见出血性坏死，腺泡小叶结构破坏，炎细胞浸润；24 h后胰腺坏死加重，胰周脂肪皂化，大量血性腹水，镜下见胰腺叶间隔、小叶间隙、腺泡间隔增宽，小叶结构紊乱，大量炎细胞浸润，胰腺腺泡细胞肿胀，有灶性坏死、出血；48 h后病理损伤继续加重。hADMSCs组胰腺组织亦出现上述变化，但损伤程度明显轻于ANP组(图2)。

四、hADMSCs在体内的分布

hADMSCs组大鼠的胰腺、肝脏、肺等器官内均可见DAPI标记的hADMSCs，以胰腺组织内数量最多(图3)，肺组织次之，肝脏组织最少。

五、各组血清淀粉酶活性及炎性因子水平的变化

正常组、假手术组、hADMSCs组的淀粉酶活性均低于ANP组，各组间差异均有统计学意义(P值均<0.05)。ANP组、hADMSCs组血TNF-α、IL-6、IL-10水平均随时间延长而升高，hADMSCs组各时间点血TNF-α、IL-6水平低于ANP组，IL-10水平高于ANP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

讨 论

重症急性胰腺炎(SAP)是常见的外科急腹症之一，即使当今对疾病的诊疗技术已有高度的发展，SAP患者的病死率仍高达16.3%[6]，早期易并发多脏器功能衰竭(MODS)，并占SAP死亡病例的50%以上[7]。在SAP早期，各种炎性细胞包括淋巴细胞、内皮细胞、单核细胞被激活，释放大量炎性递质，随病情进展炎性反应不断放大，出现全身炎症反应综合征(SIRS)，最终导致MODS。ADMSCs是来源于中胚层的多分化潜能干细胞，最早由Zuk等[8]从抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离培养获得。在恰当的诱导条件下ADMSCs能向成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层及其他胚层细胞分化，具有多系分化潜能和横向跨胚层分化能力[5]。任莉莉等[9]研究证实，经胎胰蛋白诱导，hADMSCs可以向胰腺细胞系分化。张天祥等[10]实验结果显示，经静脉移植的hADMSCs进入大鼠体内后(异种移植)未出现明显免疫排斥反应，证实hADMSCs具有良好的免疫耐受性。基于以上，hADMSCs用于小鼠ANP的治疗具有坚实的理论基础，但尚未有相关的实验研究。

图2 造模后12、24、48 h的ANP组(2A～2C)、hADMSCs组(2D～2F)胰腺组织病理改变(HE ×200)

图3 胰腺组织内DIPA染色的hADMSCs(荧光显微镜 ×200)

既往研究证实，TNF-α是ANP的始动因子[11]，IL-6参与了ANP的多脏器功能损害，IL-10具有抑制以上两种促炎因子释放的作用[12-15]。王建军等[16]研究发现ADMSCs能够显著抑制活化的淋巴细胞增殖，且这种抑制作用与ADMSCs数量呈正相关。ADMSCs亦能使Th2细胞IL-10的分泌增加。因此hADMSCs通过抑制淋巴细胞的增殖，进而抑制炎性递质的释放，增加抗炎因子的释放，在早期减轻胰腺的炎症反应[17]。本研究结果显示，与ANP组相比，hADMSCs组大鼠胰腺组织病理损伤明显减轻，血清TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平上升，与上述观点一致。

最近的研究表明移植MSCs能自动归巢到受损组织，而不归巢到未损伤组织[18]。Fischer-Valuck等[19]发现MSCs归巢主要取决于全身和局部炎症反应的强弱，IL-13和TNF-α在MSCs向损伤组织动员及归巢过程中起重要作用。单毓强等[20]研究发现MSCs注射到ANP大鼠体内，3 d后检测到有少量MSCs转化为胰腺细胞和内皮细胞，第3天与第7

表1 各组大鼠各时间点血淀粉酶活性及TNF-α、IL-6、IL-10水平的变化

注：-：无数据

天相比，MSCs的转化率略有上升，但差异无统计学意义，另外细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)对MSCs的分化具有促进作用。本研究结果显示，经大鼠尾静脉移植hADMSCs后，hADMSCs能迁移到受损的胰腺、肝脏、肺等组织内。由于本研究观察时间较短，且没有做hADMSCs转化为胰腺细胞和内皮细胞的相关检测，故有待进一步探讨hADMSCs在大鼠体内分化的机制和信号途径。

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(本文编辑：冀凯宏)

Experimental observation of human adipose mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of acute necrotic pancreatitis in rats

ZhuangPeitao,TanXueying,QiuJiantao,GeQian,XingXue,LeiChenggang.

DepartmentofHepatobiliarylaboratory,QingDaoMunicipalHospital,QingDao266011,China

LeiChenggang,Email：13589280586@163.com

Objective To observe the effect of human adipose mesenchymal stem cells (hADMSCs) on pancreatic tissue repair and inflammatory reaction of acute necrotic pancreatitis (ANP) in rat, and explore the possible mechanism. Methods Isolation and purification of hADMSCs and flow cytometry to detect the the surface markers including CD90, CD29, CD34and CD45were performed. Eighty SD male rats with the body weight of 170～210 g were randomly divided into 4 groups. There were 8 rats in the control group, 24 rats in other group. Control group underwent no treatment; sham operation group underwent intestinal wall stirring and then abdominal closure; ANP model group was established by open abdominal retrograde injection of sodium taurocholate into bile duct; and in hADMSCs group, DAPI labeled hADMSCs were injected by tail vein into the rat at 12 h after sodium taurocholate injection. The survival of the rats, and gross morphological and pathological changes of the pancreas was observed at 12, 24, and 48 h, and the serum TNF-α, IL-6, IL-10 and amylase were detected. The distribution of hADMSCs in the pancreas, liver and lung was examined in hADMSCs group. Results Rats in control group and sham operation group were all alive. In ANP group, 5 and 11 rats were dead at 24 and 48 h, respectively, and in hADMSCs group 12 rats were dead at 48 h. Compared with ANP group, the difference was not statistically significant (P>0.05).The pathological changes of the pancreas were significantly less severe in hADMSCs group than in ANP group. In hADMSCs group, the amylase at 12, 24 and 48 h was(999±110 )、(1 831±110)、(3 991±130 )U/L; TNF-α level was (62.40±2.35), (80.51±4.51) and (93.46±6.60)ng /L; IL-6 was (60.46±7.34), (80.61±8.40) and(100.58±9.49)ng /L; and these were all significantly lower than those in ANP model group [amylase (2 402±146), (3 292±137) and (5 632±112)U/L; TNF-α(87.13±3.39), (105.41±10.06), (114.57±3.06)ng/L; IL-6 (70.67±10.90)、(107.61±10.53)、(145.34±10.48)U/L], and the differences were all statistically significant (allP<0.05). IL-10 in hADMSCs group was (56.63±6.35), (81.32±5.96), (100.26±6.51)ng/L, which were increased compared with those in ANP model group [(45.26±8.04), (68.25±8.42), (80.38±5.71)ng/L], and the difference was statistically significant (allP<0.05). hADMSCs can migrate to the pancreas, liver, lungs and other damaged tissue, with most in pancreatic tissue, less in lung tissue, and least in liver tissue. Conclusions The mechanism of hADMSCs in repairing pancreatic tissue injury was associated with inhibiting TNF-α and IL-6 secreting and increasing IL-10, thus reducing inflammatory reaction.

Pancreatitis, acute necrotizing; Mesenchymal stem cells; Stem cell transplantation; Rats

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.003

266071 山东青岛，青岛大学医学部附属青岛市市立医院肝胆胰外科(庄培涛、谭雪莹、葛倩、邢雪、类成刚)；青岛大学附属医院心血管外科(邱建涛)

类成刚，Email:13589280586@163.com

青岛市科委课题[12-1-4-16-(5)-jch]

2016-04-30)