STZ诱导糖尿病大鼠新物体识别能力的动态监测

吴 雪，周 游，李佳丽，刘 蕊，赵 瑛

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

STZ诱导糖尿病大鼠新物体识别能力的动态监测

吴 雪，周 游，李佳丽，刘 蕊，赵 瑛

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

研究链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠模型在造模80 d内，新物体识别能力的动态变化.60 mg/kg腹腔注射STZ，72 h后检测空腹血糖≥16.7 mmol/L为模型复制成功，记录DM模型的成模率；模型制备第40、55、70天采用大鼠行为仪以接触次数、相对识别指数为指标，检测大鼠新物体识别行为的变化并记录空腹血糖变化及整个实验期间的死亡率.结果表明, 造模72 h后DM的成模率为90%，整个实验期间的死亡率为21.7%；模型组的空腹血糖在造模第3、30、60、80天显著高于对照组(P<0.01)；模型组大鼠在造模第40d对新物体的相对识别指数与对照组无显著性差异(P>0.05)，在造模第55、70天显著低于对照组(P<0.05)，模型组大鼠在造模第40、55、70天对新物体的探究次数均显著低于对照组(P<0.05). 以60 mg/kg的剂量腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第55天开始出现新物体识别障碍，持续至70 d.

糖尿病；认知损害；新物体识别

DM致认知损害的发病过程隐秘，进一步发展就会形成痴呆，因此DM所致的认知功能障碍引起越来越多人的关注[1]，在痴呆发生之前认知损害常常是被忽略的，如果在认知障碍的初级阶段加以干预，可以有效延缓痴呆的发生.由于目前多采用Morris水迷宫检测学习记忆能力，但其记忆保持时间长的特殊性，不能对动物学习记忆行为进行连续的动态监测，因此我们尝试选用新物体识别方法动态观察认知损害的发病过程 .新物体识别方法是在自然状态下测量动物非空间工作记忆的行为模型[2].目前通过新物体识别方法研究DM致认知损害的发病过程未见报道[3-4].因此本实验通过60 mg/kg腹腔注射STZ复制DM大鼠模型，采用新物体识别方法动态监测DM致认知损害的发病过程.

1 实验材料

1.1 实验动物及饲养条件

雄性Wistar大鼠46只，8～11周龄，体重(250±20)g由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号201600013063.实验动物采用独立通气笼饲养，温度(20～22) ℃，湿度45%～55%，换气次数34次/h，每笼4只，实验动物采用标准饲料喂养，实验期间可自由摄食、饮水.

1.2 实验试剂及设备

STZ(北京博爱科贸有限公司，Sidma-S0130)，葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，20141105147)，血糖仪(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，悦准血糖仪11型)，独立通气笼(S8苏州市苏杭科技器材有限公司)，精密pH计(上海虹益仪器仪表有限公司，PHS0-3C)，分析天平(上海越平科学仪器有限公司，FA1004)，酶标分析仪(RAYTO公司，RT-6000)，新物体识别装置箱(64cm*43cm*30cm)，三套新物体(每套分别含两种物体，自制)，计时器.

2 实验方法

2.1 STZ溶液配制

柠檬酸(A)：2.10 g柠檬酸溶于100 mL蒸馏水；柠檬酸钠(B)：2.94 g柠檬酸钠溶于100 mL蒸馏水；A液、B液按1∶1.32比例混合，测定pH值，调节pH值为4.2～4.5，微孔滤膜(Φ=0.22 μm)过滤除菌，置于4 ℃冰箱备用.STZ粉末以上述缓冲溶液配成1%的溶液，现用现配，避光冰浴，溶解后立即注射，在10 min内注射完毕.

2.2 动物分组及模型复制

动物适应性喂养1周后，按体重随机分为对照组(n=16)，模型组(n=30).实验动物禁食不禁水12 h，模型组以“2.1”项下配制的STZ按60 mg/kg的剂量腹腔注射，对照组注射同等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，注射2 h后给食.以72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[5-6]，达到此标准的动物纳入实验.

2.3 血糖测定

取造模72 h时的空腹血，3 500 r/min离心10 min取上清，采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L为造模成功.且分别在造模后的第30、60、80天用血糖仪对大鼠进行空腹血糖测定，超出血糖仪检测限的记为33.3 mmol/L.

2.4 新物体识别能力检测

2.4.1 大鼠新物体兴趣测试

将3套(每套均含1号物体和2号物体)新物体同时置于箱内，用秒表记录大鼠对几个不同物体的探究次数及探究时间，结果显示同一只鼠对三套物体的探究次数及探究时间无显著性差异(P>0.05).因此在正式试验中选用这三套物体进行新物体识别能力测试.

2.4.2 新物体识别方法

新物体识别实验过程分为3个阶段：适应期、熟悉期和测试期[7].适应期为2 d，每天上下午分别将动物依次放入没有任何物体的实验箱内，适应环境5 min.第3天，熟悉期实验，将两个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10 cm.让大鼠在试验箱内自由探索5 min[8].24 h之后进行测试期实验，将其中一个熟悉期使用的物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新物体，分别记录动物对新物体探究的平均速度、路程、探究次数及对两个不同物体的探究时间.用相对识别指数(relative discrimination index)来评价动物的学习记忆能力[9].相对识别指数的计算为N/(N+F)×100%，其中N(new)为新物体探索时间，F(familiar)为熟悉物体探索时间.在每次进行实验时，需清理上次实验时大鼠在活动箱内的排泄物，并用酒精擦拭活动箱，以消除对下只鼠实验的影响[10].

2.5 代谢情况考察

代谢笼中放入定量的食、水，动物放入代谢笼中自由摄食、饮水，12 h后计算大鼠的食量、水量、尿量及体重.分别在模型成立后第6、30、60、80天对以上指标进行检测[11].

2.6 数据统计

应用SPSS 17.0 For Windows统计软件，正态分布采用方差分析进行数据资料处理，作方差齐性检验，P>0.05为方差齐性，P<0.05为方差不齐.方差齐性时，组间比较采用LSD检验.方差不齐时，采用多重比较Tamhane检验.结果均以平均值±标准差(X±S)表示.P<0.05为有显著性差异；P<0.01为有非常显著性差异.

3 实验结果

3.1 成模率、死亡率及代谢情况

本次实验以造模72 h空腹血糖≥16.7 mmol/L为成模标准，有27只大鼠成模，成模率为90%，80 d时两组大鼠共死亡10只(对照组死亡2只，模型组死亡8只)，死亡率为21.7%，且模型组大鼠在成模第3、30、60、80天，空腹血糖与对照组均有非常显著差异(P<0.01).模型组的食量与体重，在造模第6天与对照组无显著性差异(P>0.05)，在造模第30、60、80天均与对照组有显著性差异(P<0.05)，模型组的水量与尿量在造模第6、30、60、80天显著高于对照组(P<0.05)见表1,2.

表1 空腹血糖变化(FBG/(mmol·L-1))

注：与对照组相比，**P<0.01说明有非常显著性差异

表2 大鼠食量、水量、尿量、体重变化

注：与对照组相比，*P<0.05说明有显著性差异，**P<0.01说明有非常显著差异

3.2 新物体识别能力

与对照组相比，模型组大鼠对新物体探究路程与平均速度在造模第40、55、70天无显著性差异(P>0.05)，故可排除运动能力的影响，对新物体的探究次数在造模第40、55、70天显著降低(P<0.01)，相对辨别指数在造模第40天无显著性差异(P>0.05)，在造模第55、70天显著降低(P<0.05).见表3.

表3 测试期两组大鼠对新物体的探究次数与相对辨别指数

注：与对照组相比，*P<0.05说明有显著性差异，**P<0.01说明有非常显著性差异

4 讨 论

本实验前期根据动物体重范围，通过腹腔注射STZ以55、60、65 mg/kg的剂量进行预实验，结果证明60 mg/kg的剂量成模率高，故正式实验以60 mg/kg剂量一次性腹腔注射复制DM模型.空腹血糖显示，全部造模动物一直维持高血糖状态，且模型组大鼠一直维持“三多一少”症状，可以看出本实验所建立的DM模型在80 d内稳定.

新物体识别实验在近些年应用广泛，在国内外的研究日趋增多.它主要用于啮齿类动物非空间及短期对物体的辨别记忆能力的检测.整个实验过程分为：适应期，熟悉期及测试期，由于熟悉期与测试期之间的间隔时间文献中不尽相同，大多以间隔2h和24h居多，因此本实验前期通过设置间隔2h和24h分别进行预实验，结果证明间隔24h时，模型组与对照组的实验结果差异性更加明显，故正式实验采用熟悉期与测试期间隔24h.

综上所述，以60mg/kg腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第40d，模型组大鼠的相对辨别指数与对照组无显著性差异，而在第55、70天显著减少，说明DM大鼠在造模第55天开始出现新物体识别障碍，并持续至70d.本实验的进行，为DM认知损害的早期发现、预防及药物干预的研究提供了一定实验依据.

[1] 温伟添. 浅析高血压糖尿病等病症的合理用药[J]. 海峡药学, 2010, 22(6): 222-224.

[2]VIEIRABROCKPL,MCFADDENLM,NIELSENSM, et al.Nicotineadministrationattenuatesmethamphetamine-inducednovelobjectrecognitiondeficits[J].InternationalJournalofNeuropsychopharmacology, 2015, 18(12): 46-38.

[3] 刘行海, 买文丽, 郑 倩, 等. 葡萄籽原花青素对2型糖尿病大鼠认知障碍的影响[J]. 辽宁中医药学学报, 2016,18(4): 22-24.

[4] 胡海燕, 徐志伟, 敖海清, 等. 四逆散影响慢性应激抑郁模型大鼠行为学研究[J]. 中华中医药杂志, 2016, 31(1): 271-274.

[5] 赵圆宇, 工艺蓉, 徐彩婷, 等. 性别差异对1型糖尿病大鼠造模的影响[J]. 川北医学院学报, 2014, 29 (5): 421-424.

[6] 卢俞任, 刘 义. 小剂量阿司匹林对糖尿病人鼠肾脏保护作用研究[J]. 中国动脉硬化杂志, 2013, 21 (5) : 419 -423.

[7]SCOTTGA,MTETWAM,LEHMANNH.Novelodourrecognitionmemoryisindependentofthehippocampusinrats[J].ExperimentalBrainResearch, 2013, 224(2): 199-209.

[8] 农田泉. 半夏秫米汤对小站台水环境睡眠剥夺大鼠八臂迷宫空间学习记忆能力的影响[J]. 实用中医内科杂志, 2012, 26(5): 36-38.

[9]PEZZEMA,MARSHALLHJ,FONEKCF, et al.DopamineD1receptorstimulationmodulatestheformationandretrievalofnovelobjectrecognitionmemory:Roleoftheprelimbiccortex[J].EuropeanNeuropsychopharmacology, 2015, 25(11): 2145-2156.

[10]SANEYOSHIA,MICHIMATAC.Categoricalandcoordinateprocessinginobjectrecognitiondependsondifferentspatialfrequencies[J].CognitiveProcessing, 2015, 16(1): 27-33.

[11] 赵家维，曹秀玲，李 璇.I型糖尿病患者血糖偏微分控制模型(下)[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2016，32(6)：682-685.

Dynamic monitoring of new object recognition ability of STZ induced diabetic rats

WU Xue, ZHOU You, LI Jia-li, LIU Rui, ZHAO Ying

(School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To study the dynamic change of new object recognition ability of streptozotocin(STZ)-induced diabetic rat model in 80 days. Normal rats were treated with intraperitoneal injection of STZ of 60 mg/kg to establish model. On the 3rd day, fasting plasma glucose levels was detected, when the value was over 16.7 mmol/L the modeling was successful. The success rate of MD model was recorded. Preparation model 40 d, 55 d, 70 d with large mouse behavior to contact the instrument number, relative identification index as an indicator to detect changes in rat new object recognition behavior, in addition, record the mortality rate and fasting glucose during the experiment. The mold forming rate was 90% in third days, the mortality rate during the experiment was 21.7%; The model group of fasting blood glucose in third days, 30 days, 60 days, 80 days were significantly higher than control group (P<0.01)；control group and model group there was no significant difference in 40 days of relative recognition index(P>0.05), the model group, in 55 days，70 days was significantly lower than control group (P<0.05)；the model group, in 40 days，55 days，and 70 days of the new object exploring times were significantly lower than control group (P<0.05). The diabetic rat model established by intraperitoneal injection with the dose of 60 mg/kg in 55 days began to appear new object recognition obstacle, and continued to 70 days.

diabetes mellitus; cognitive impairment; new object recognition

2016-11-17.

国家自然科学基金资助项目(81373548)

吴 雪(1990-)，女，硕士，研究方向：中药防治重大疾病

赵 瑛(1960-)，女，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：中药防治重大疾病

R285

A

1672-0946(2017)02-0135-03