高效液相色谱法测定辣椒中的辣椒碱类成分

袁丽丽，王海翔，洪桑桑，王岁楼

（中国药科大学，江苏南京 211198）

高效液相色谱法测定辣椒中的辣椒碱类成分

袁丽丽，王海翔，洪桑桑，*王岁楼

（中国药科大学，江苏南京 211198）

建立了高效液相色谱法同时测定辣椒中辣椒碱和二氢辣椒碱含量的方法。采用Ultimate AQ-C18型色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相为水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长280 nm。辣椒碱和二氢辣椒碱在0.001~0.150 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好（R2=0.999 9）；加样回收率均值分别为99.35%和98.26%，RSD分别为0.82%和0.73%（n=9）；稳定性试验RSD为0.27%；中间精密度RSD低于3.79%（n=18）。该法准确度高、重现性好，能快速测定辣椒中辣椒碱和二氢辣椒碱的含量。

高效液相色谱法；辣椒碱；二氢辣椒碱；辣椒

辣椒，又名番椒、辣子等，是一种药食同源的茄科植物。除了作为蔬菜和调味品外，其果实和根茎可入药，具有温中散热、健胃消食之功效[1]。辣椒中含有脂肪、维生素、蛋白质、生物碱等多种成分[2]，VC含量居蔬菜之首，具有较高的营养价值。辣椒碱类化合物是辣椒果实中产生辛辣味道的主要成分，是一类同源的香草酰胺类生物碱，主要有辣椒碱（CA）、二氢辣椒碱（DC）、降二氢辣椒碱（NDC）、高辣椒碱（HC）和高二氢辣椒碱（HDC）等。其中，辣椒碱占46%~77%，二氢辣椒碱占21%~ 40%，二者占90%以上[3]，是辣椒品质的重要指标。辣椒碱亦是辣椒中主要活性成分，因具有镇痛、抗肿瘤、保护心血管、减肥等药理作用[4-7]，使其在医药领域的应用得到广泛关注。美国医学会将其作为临床上治疗疱疹后神经痛、糖尿病性神经痛的首选药物。除此之外，辣椒碱还可用来制作生化农药、军事上的催泪弹等，具有广泛用途。

试验采用超声辅助提取法对辣椒粉样品进行处理，以辣椒碱和二氢辣椒碱为对照品，建立了高效液相色谱法同时检测两者的含量，并进行了方法学验证。结果表明，该法专属性强、准确度高、精密度良好，能很好地检测辣椒粉中辣椒碱和二氢辣椒碱的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、柱温箱、可变波长紫外检测器和Chromeleon 7工作站），美国Dionex公司产品；DV215CD型电子天平，美国OHAUS公司产品。

1.2 试剂

辣椒碱对照品（批号10L046，含量94.1%）、二氢辣椒碱对照品（批号X1800010，含量98.98%），上海安谱实验科技股份有限公司产品；辣椒粉，兴化市盛华食品有限公司产品；甲醇（色谱纯），上海星可高纯化学试剂有限公司产品；纯净水，杭州娃哈哈集团产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate AQ-C18型色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相：水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL，检测波长280 nm。

2.2 溶液配制

（1）对照品溶液。精密称取辣椒碱和二氢辣椒碱对照品约10 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，摇匀，制成每1 mL约含0.1 mg CA和DC的对照品溶液。

（2）样品溶液。称取辣椒粉约2.0 g，置于250 mL烧杯中，加入甲醇30 mL，于室温下超声提取2次，每次20 min；合并提取液，浓缩至干，用90%甲醇水溶解定容至10.0 mL；精密量取该溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀释定容，作为样品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

精密量取空白溶剂、对照品溶液、样品溶液各20 μL，按照2.1项中色谱条件进行测定，记录色谱图。空白溶剂和样品溶液中的杂质对CA峰和DC峰无干扰。

空白溶剂（a）、对照品溶液（b） 和样品溶液（c）色谱见图1。

2.3.2 线性关系考察

取CA和DC对照品约10 mg，精密称量，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，制成质量浓度为1 mg/mL的对照品母液；精密量取该溶液10，50，100，300，600，900，1 200，1 500 μL，分别置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀释定容，制成系列质量浓度的标准溶液。精密吸取上述标准溶液各20 μL，按照2.1项中色谱条件进行测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为YCA=198.76X-0.063 1（R2= 0.999 9），YDC=204.22X-0.099 5（R2=0.999 9），结果表明，CA和DC在0.001~0.150 mg/mL范围内峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

图1 空白溶剂（a）、对照品溶液（b）和样品溶液（c）色谱

2.3.3 定量限和检测限

取2.3.2项下的对照品母液适量，用90%甲醇水逐步稀释成不同质量浓度的标准溶液，按照2.1项中色谱条件进行测定。得该方法的最低检测限质量浓度为0.5 μg/mL，最低检测限0.01 μg（S/NCA=5.1，S/NDC=3.8）；最低定量限质量浓度为1 μg/mL，最低定量限0.02 μg（S/NCA=12.4，S/NDC=9.7）。

2.3.4 稳定性试验

取CA和DC对照品适量，精密称量，用90%甲醇水制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h后进样，按照2.1项中色谱条件进行测定。结果表明，对照品溶液在24 h内稳定，CA和DC的色谱峰面积无明显变化，RSD值分别为0.25%和0.27%。

2.3.5 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，按照2.1项中色谱条件进行测定。结果显示，CA色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值分别为0.12%和0.28%；DC色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值分别为0.16%和0.46%，精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取辣椒粉6份，按照2.2项中的方法配制样品溶液，按照2.1项中色谱条件进行测定。以外标法计算CA和DC的含量，结果得CA和DC的含量均值分别为0.305 mg/g和0.228 mg/g，RSD值分别为0.42%和1.75%，表明此法重复性良好。

2.3.7 中间精密度试验

取辣椒粉，按照2.2项中的方法配制样品溶液，由不同工作人员在不同时间使用不同仪器对样品溶液进行测定，以外标法计算CA和DC的含量，结果得CA和DC的含量均值分别为0.296 mg/g和0.222 mg/g，RSD值分别为3.24%和3.79%（n=18），表明此法具有良好的中间精密度。

2.3.8 加样回收率试验

取辣椒粉9份，分别加入不同体积的对照品母液（相当于对照品溶液浓度的80%，100%和120%），按照2.2项中的方法配制样品溶液，按照 2.1项中色谱条件进行测定，计算CA和DC的含量并计算回收率。

加样回收率试验结果（n=9）见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=9）

由表1可知，表明该法的回收率良好。

2.3.9 耐用性试验

取对照品溶液和样品溶液，分别考察柱温、流速、有机相比例对测定结果的影响。

耐用性试验结果见表2。

表2 耐用性试验结果

由表2可知，上述色谱条件的微小变化对测定结果影响较小。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取CA和DC对照品，制成一定质量分数的甲醇溶液进行紫外光谱扫描，结果显示在波长227 nm和280 nm处有吸收峰，考虑到280 nm处波长较长，不易受其他物质的干扰，因此选择280 nm为检测波长。

CA（a）和DC（b）紫外扫描光谱见图2。

图2 CA（a）和DC（b）紫外扫描光谱

3.2 流动相的选择

辣椒碱类物质极性很弱，在C18柱上保留很强，试验选择水和甲醇为流动相体系，随着甲醇比例的增大，主峰保留时间缩短。由于CA色谱峰前、DC色谱峰后各有一杂质峰，当甲醇比例低于60%时，分离度无法满足要求。而且从样品溶液色谱图1（c）中可以看出，提取液中的杂质较多，主要集中在15 min之前出峰，因而使主峰保留时间在20 min之后。试验也参考美国药典中辣椒碱原料药的检测方法，在流动相中加入0.1%的磷酸，发现色谱峰形并没有得到明显改善。因此，最终确定流动相为水-甲醇（40∶60，V/V）。根据文献[8]推测，对照品溶液色谱图1（b）中的杂质峰1可能是降二氢辣椒碱（NDC），杂质峰2可能是高辣椒碱（HC），这有待于进一步确证。

3.3 溶剂的选择

试验考察了不同比例的甲醇水溶液作溶剂时，主峰的峰形变化。

不同溶剂下CA和DC色谱峰的拖尾因子见表3。

表3 不同溶剂下CA和DC色谱峰的拖尾因子

由表3可知，当甲醇比例为90%时，两主峰的峰形最好。除此之外，还考察了辣椒粉甲醇提取物在不同溶剂中的稳定性，结果发现当溶剂中甲醇比例低于90%时，放置一段时间后，溶液底部会有颜色较深的油状物沉淀。因此，选择90%甲醇水为溶剂。

4 结论

辣椒碱类成分是一系列同源的香草酰胺类生物碱，是辣椒中辛辣成分的主要来源，其中辣椒碱和二氢辣椒碱约占90%以上，是辣椒品质和生理活性的代表性物质。研究建立了高效液相色谱法同时测定辣椒粉中辣椒碱和二氢辣椒碱含量的方法。该法的样品提取工艺简单，避免了繁琐过程和剧烈条件导致的辣椒碱成分的损失及破坏；且在样品色谱图中主峰位置没有杂质干扰，专属性强；方法精密度良好、准确度高，具有较强的抗干扰能力，为辣椒的品质评价和生理活性检测提供了手段。

[1]王国强.全国中草药汇编 [M].北京：人民卫生出版社出版，2014：668-669.

[2]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 [M].北京：科学出版社出版，1978：61-63.

[3]Govindarajan V S.Capsicum production，technology，chemistry，and quality-Part II.Processed products，standards，world production and trade[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1986，23（3）：207-288.

[4]郭军华，黄烽，吴东海，等.辣椒碱治疗关节痛的Ⅱ期临床研究 [J].中国新药杂志，2002，11（12）：949-951.

[5]Peppin J F，Majors K，Webster L R，et al.Tolerability of NGX-4010，a capsaicin 8%patch for peripheral neuropathic pain[J].Journal of Pain Research，2011（4）：385-392.

[6]Haanpaa M，Treede R D.Capsaicin for neuropathic pain：linking traditional medicine and molecular biology[J]. European Neurology，2012，68（5）：264-275.

[7]Zhang R，Humphreys I，Sahu R P，et al.In vitro and in vivo induction of apoptosis by capsaicin in pancreatic cancer cells is mediated through ROS generation and mitochondrial death pathway[J].Apoptosis，2008，13（12）：1 465-1 478.

[8]韩玉珠，石磊岭，金莎，等.反相高效液相色谱法测定辣椒中4种辣椒碱类成分的含量 [J].食品科学，2012，33（16）：257-260.

Determination of Capsaicinoids in Chili Peppers by HPLC

YUAN Lili，WANG Haixiang，HONG Sangsang，*WANG Suilou
（China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211198，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC） method is established to simultaneously determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili peppers.The HPLC method are performed on a Ultimate AQ-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm） using a mobile phase of methyl alcohol and water（40∶60，V/V） at a flow rate of 1.0 mL/min.The colum temperature is matained at 30℃and the detection wavelength is set at 280 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of capsaicin and dihydrocapsaicin in the range of 0.001~0.150 mg/mL（R2=0.999 9）is observed.The average recovery rates is 99.35%and 98.26%of capsaicin and dihydrocapsaicin respectively with an RSD of 0.82%and 0.73%（n=9）.The stability RSD is 0.27%.The intermediate precision RSD is lower than 3.79%（n=18）.This method can be used to determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili pepper rapidly with high accuracy and good repeatability.

HPLC；capsaicin；dihydrocapsaicin；chili peppers

TS255.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.040

1671-9646（2017）02b-0045-03

2017-01-04

中央高校基本科研业务费（3010010152）。

袁丽丽（1991— ），女，在读硕士，研究方向为食品与药品质量。

*通讯作者：王岁楼（1961— ），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为食品与药品质量。