食品中罗丹明B的高效液相色谱串联质谱法检测

叶佳明，汪庆旗，应寒松，叶磊海，王庆龄

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江赞宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

食品中罗丹明B的高效液相色谱串联质谱法检测

叶佳明1，2，汪庆旗1，2，应寒松1，2，叶磊海1，2，王庆龄1，2

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江赞宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

建立了使用高效液相色谱串联质谱法检测食品中罗丹明B含量的分析方法。食用油样品经70%甲醇水溶液提取后，直接可用于进样分析，固体样品以70%甲醇溶液提取、MCX固相萃取柱净化，经色谱柱分离后，以0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脱，经ESI+模式、多反应模式（MRM）进行检测。结果表明，罗丹明B在1.0~100.0 ng/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系，空白样品加标的回收率在90.3%~96.8%，相对标准偏差（RSD）均小于5%，检出限为0.5 μg/kg，具有快速、准确、灵敏度高等优点，适用于食品中罗丹明B的定性和定量分析。

罗丹明B；固相萃取；液相色谱串联质谱

罗丹明B又称为碱性玫瑰精，是一种鲜桃红色的三苯甲烷类碱性人工合成染料，具有持久鲜艳的荧光特性和良好的脂溶性[1]，因其具有高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等特性[2]，我国和欧盟等都不允许在食品中添加，但仍有部分不法商企使用罗丹明B对辣椒等调味料进行染色。目前，食品中罗丹明B的检测方法主要使用高效液相色谱-荧光法和高效液相色谱-质谱法[3-4]。这2种检测方法均能满足对低残留罗丹明B的检测，主要存在的问题集中在样品的提取净化过程，作为检测标准被实验室广泛使用的仅有SN/T2430—2010进出口食品中罗丹明B的检测方法。该方法采用凝胶净化系统GPC进行纯化，采用液相色谱荧光检测器或质谱检测器进行分析，使用GPC净化存在有机溶剂使用量大、操作繁琐、难以批量操作等问题。另一种常用的净化手段是使用中性氧化铝柱净化[5]，但中性氧化铝柱法净化存在准备周期长、样品回收率不稳定等问题。乔勇升等人[6]对食用油中的罗丹明B采用丙酮提取，经MCX阳离子固相萃取柱净化后采用超高效液相色谱-串联质谱检测，但丙酮试剂应用范围小，不适用其他类食品中罗丹明B的检测。试验以70%甲醇水为提取液，食用油等常规样品简单处理即可直接检测，复杂基质样品使用固相萃取柱富集净化，以高效液相色谱串联质谱法进行定性、定量检测分析。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，Agilent 6460型三重四级杆串联质谱仪，AR2140型电子分析天平，IKA VORTEX GENIU 3型涡旋混合器，TGL-16G型台式离心机，KS-300EI型超声波清洗器，氮吹仪。

甲醇（色谱级），乙腈（色谱级），丙酮（色谱级），正己烷（色谱级），罗丹明B标准品（Sigma公司产品，纯度95%），Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm），OasisHLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm）。

1.2 试验方法

1.2.1 提取

（1）丙酮提取。称取2.0 g食用油样品于50 mL离心管中，加入10 mL丙酮涡旋溶解后，经MCX小柱净化，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，再依次用3 mL丙酮，3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，用3 mL 5%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜后，待测。

（2）乙腈水提取。称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液涡旋3 min，超声提取20 min。以转速4 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后，待测。

（3） 乙腈水-正己烷提取。称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液涡旋3 min，再加入5 mL正己烷涡旋振荡，超声提取20 min。以转速4 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷层，下层液体过0.22 μm滤膜后，待测。

1.2.2 净化

取2 mL 70%乙腈水提取液于40℃下氮气吹干，去除有机相后过HLB小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，用3 mL水淋洗，用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜后，待测。

取2 mL 70%乙腈水提取液过MCX小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，依次用3 mL0.1 mol/L盐酸水溶液，3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18，RRHD 1.8 μm，2.1 mm× 100 mm；流动相：0.1%甲醇水溶液和乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样量：2 μL。

梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.2.4 质谱条件

电喷雾ESI离子源；正离子扫描模式；多反应检测模式（MRM）。

质谱离子源参数见表2，MRM质谱参数见表3。

表2 质谱离子源参数

表3 MRM质谱参数

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

罗丹明B具有较强的极性，易溶于水、甲醇和乙腈，微溶于丙酮。对于水溶性样品溶解后即为提取完全，但含油脂样品中需要加入一定比例的甲醇或者乙腈才能提高提取率，通过试验比较，70%甲醇水溶液提取效果理想且回收率稳定。试验采用70%甲醇水作为提取溶液，并比较了文献[6]报道中丙酮提取效果。正己烷能有效去除脂肪，加入正己烷混合提取后，经离心处理，能充分去除提取液中的少量油脂。试验考察了加入正己烷后对罗丹明B提取效果的影响。

不同溶剂提取回收率见表4。

表4 不同溶剂提取回收率

针对辣椒油、花椒油等食用油样品分别用丙酮、70%乙腈水溶液，70%乙腈水-正己烷溶液提取，均有较好的提取效果。由表4可知，3种提取液的平均加标回收率在89.2%~98.6%，丙酮提取液与70%乙腈水提取液提取效果基本相似，70%乙腈水-正己烷提取液平均回收率在90%左右，略低于其他2种提取液，这可能是由于少量罗丹明B残留在正己烷溶剂中。加入正己烷后虽能去除提取液中的油脂，但也降低了罗丹明B的提取率，综合考虑不使用正己烷净化处理。为考察实际样品的提取效果，选取3个阳性辣椒油样品，分别采用丙酮、70%甲醇水、70%甲醇水-正己烷溶液提取，3种提取液中70%甲醇水提取液测定结果最高，丙酮其次，70%甲醇水-正己烷溶液提取效果略差，只有70%甲醇水提取率的90%左右，与加标试验结果一致。针对食用油样品以70%甲醇水溶液提取即可直接分析检测，使用丙酮提取还需要过柱净化，综合分析采用70%甲醇水作为提取溶液。

辣椒油中不同溶剂提取罗丹明B测定值见图1。

图1 辣椒油中不同溶剂提取罗丹明B测定值

2.2 固相萃取柱净化

食用油样品通过70%甲醇水提取，即可进行测定分析，对于其他复杂基质的样品，仅采用70%甲醇提取后，提取液杂质含量多、基质效应大，会影响测定的准确性；采用固相萃取柱净化后，能大幅降低基质效应的影响，并能提高仪器的灵敏度。根据罗丹明B结构中具有氨基、羧基和苯环，分别选取阳离子交换固相萃取柱（Oasis MCX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）进行净化效果考察。按试验方法进行样品净化，结果显示，以Oasis MCX柱净化回收率为95.2%±2.0%，以Oasis HLB柱净化回收率为89.4%±3.2%，二者均能满足罗丹明B的分析检测要求。二者相比较，Oasis MCX柱回收率更高、操作更简单，提取液不需要去除有机溶剂即可直接过柱净化，因此选用Oasis MCX柱作为净化萃取柱。

2.3 标准曲线和检出限

分别配置标准溶液，质量浓度分别为1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 ng/mL进行分析，以定量离子色谱峰峰面积为纵坐标、罗丹明B质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

罗丹明B的浓度在1.0~100.0 ng/mL范围内呈线性分布，其线性回归方程为Y=9 035.1X+855.8，相关系数为0.999 8。采用空白基质添加罗丹明B标准品的方法，以3倍信噪比计算罗丹明B的检出限为0.5 μg/kg。

罗丹明B标准品的液质总离子流图及MRM图（质量浓度为50 ng/mL）见图2。

2.4 方法精密度和回收率

选取辣椒油、黄豆酱、花生样品，添加不同含量的罗丹明B标准品，按试验方法进行处理，平行测定6份。

精密度和回收率（n=6）见表5。

由表5可知，样品的平均加标回收率在90.3%~ 96.8%，相对标准偏差（RSD）均小于5%。结果表明，此方法具有良好的准确性和可靠性。

图2 罗丹明B液质总离子流图及MRM图

表5 精密度和回收率（n=6）

3 结论

试验研究了食品中罗丹明B高效液相串联质谱检测方法，比较了不同溶剂的提取效果，通过MCX固相萃取柱净化后，降低了样品的基质效应，去除了大部分杂质，空白样品加标回收和重复性良好。该法具有快速、准确、灵敏度高等优点，适用于食品中罗丹明B的定性和定量分析，也为其他类似工业染料的检测方法提供参考。

[1]咸瑞卿，高文超，王小兵，等.调味品中罗丹明B的HPLCFLD-DAD测定方法研究 [J].中国调味品，2013（38）：109-111.

[2]王传现，韩丽，方晓明，等.食品中罗丹明B的高效液相色谱荧光检测 [J].分析仪器，2008（1）：27-30.

[3]林清荷，陈鑫，吴忠兴.辣椒粉中罗丹明B液相色谱检测方法的研究 [J].农产品加工（学刊），2012（11）：157-159.

[4]朱晓军，颜春荣，董璨，等.固相萃取-液质联用同时检测豆制品中4种红黄色系工业染料 [J].2012（6）：190-194.

[5]薛昆鹏，金小青，余冲，等.固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定辣椒制品中的罗丹明B[J].食品安全质量检测学报，2016，7（6）：2 375-2 380.

[6]乔勇升，韩芷玲，刘媛，等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定食用调味油中的罗丹明B[J].理化检验-化学分册，2013，49（7）：844-847.

Determination of Rhodamine B in Food by High Performance Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectromrtry

YE Jiaming1，2，WANG Qingqi1，2，YING Hansong1，2，YE Leihai1，2，WANG Qingling1，2
（1.Zhejiang Gongzheng Testing Center Co.，Ltd.，Hangzhou，Zhejiang 310009，China；2.Zhejiang Zanyu Technology Group Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310009，China）

An analysis method is established for detecting the content of Rhodamine B in food using performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry.Sample of edible flavoring oil is extracted with 70%methanol water solution，which can be directly used for analysis.Solid sample is extracted with 70%methanol，the extracting solution is taken for purification by MCX cation solid phase extraction column，and then separated by C18column，using acetonitrile and 0.1% formic acid solution for gradient elution，detected by positive ESI+and multi-reactions monitoring modes.The result shows that the linearity of Rhodamine B is better in the range of 1.0~100.0 ng/mL.Test for recovery are made at different concentration levels of Rhodamine B standard，giving values of recovery in the range of 90.3%~96.8%，with RSD less than 5%.The detection limit of Rhodamine B is 0.5 μg/kg.The method has the characteristics of low detection limit and high sensitivity，so it is suitable for qualitative and quantitative analysis of Rhodamine B in food.

Rhodamine B；solid phase extraction；performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry

O658

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.042

1671-9646（2017）02b-0052-03

2017-01-06

叶佳明（1987— ），男，硕士，助理工程师，研究方向为食品检测。