浆细胞瘤异位基因1表达下调对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响及机制

李敏，吴汪丽，彭云，肖一平

(广州医科大学附属第二医院，广州510260)

糖尿病肾病是终末期肾脏疾病的主要发病原因，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因[1]。长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，主要通过调节蛋白编码基因，影响蛋白质编码基因的表达水平、稳定性和细胞定位等，参与调控多种进程，如细胞分化、生长发育、肿瘤的发生发展等[2,3]。研究发现，许多lncRNA在肾脏发育和肾脏疾病发病中发挥一定的调控作用[4]。浆细胞瘤异位基因1(PVT1)为lncRNA，是目前惟一一个与肾脏疾病相关的lncRNA[5]，与糖尿病肾脏疾病的发生和发展密切相关。研究发现，PVT1在糖尿病患者的肾小球系膜细胞表达丰富，但不表达相关蛋白，其可能代表一个非编码RNA，当发生扩增和过度表达时，可促进细胞增殖[6]。肾小球细胞外基质(ECM)的过度堆积在糖尿病肾病发展中发挥核心作用[7,8]。2015年2月～2016年5月，我们采用小干扰RNA(siRNA)技术抑制肾小球系膜细胞PVT1 mRNA表达，观察下调PVT1表达对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖及ECM相关蛋白表达的影响，探讨PVT1在糖尿病肾脏疾病发生、发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人肾小球系膜细胞购自美国Scien Cell公司。胎牛血清和DMEM购自美国Gibco公司；siRNA转染试剂Lipofecttamine2000购自美国Invitrogen公司；Annexinv-FITC/PI凋亡试剂盒和周期检测试剂盒购自中国凯基公司；PVT1、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(PAT-1)、羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；总蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 胶试剂盒购自中国碧云天公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒购自日本Takara公司；PVT1 siRNA和control siRNA由上海吉凯制药技术有限公司合成。

1.2 细胞分组、干预及转染方法 细胞培养后，以2×105/孔常规培养于6孔板，分为正常对照组、高糖组、高糖+control siRNA组、高糖+PVT1 siRNA组。正常对照组在5.55 mmol/L的低糖DMEM完全培养基中培养，高糖组、高糖+control siRNA组、高糖+PVT1 siRNA组均在25 mmol/L的高糖DMEM完全培养基中培养。待融合度达70%时，将高糖+control siRNA组、高糖+PVT1 siRNA组培养基换成Opti-MEM培养基，严格按GenePharma RNAi产品使用手册的Protocol进行操作，分别转染control siRNA、PVT1 siRNA。

1.3 细胞增殖检测 采用CCK-8法。各组细胞于37 ℃、5%CO2条件下分别培养0、24、48、72 h后，严格按CCK-8试剂盒说明书步骤进行操作，测定每个时间点各组细胞OD值，以实验组OD值/阴性对照组OD值×100%计算细胞增殖率。

1.4 细胞周期检测 采用流式细胞术。将各组细胞消化收集，制备单细胞悬液，预冷PBS清洗2～3次，重悬细胞于EP管中，70%乙醇固定，-20 ℃过夜，PI/Rnas染色，按细胞周期检测试剂盒说明书操作，于流式细胞仪上检测细胞G1、S期的比例。

1.5 PVT1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。各组细胞培养48 h时，去掉原培养基，使用预冷的PBS洗涤细胞；TRIzol法提取细胞总RNA，以提取的总RNA为模板，逆转录cDNA，反应体系为70 ℃，保温10 min后迅速在冰上冷却2 min，42 ℃ 60 s，72 ℃ 15 s。按照 qRT-PCR试剂盒(RR420A)SYBR Green法进行扩增，扩增40个循环周期，每个标本3个复孔。人PVT1引物序列为上游：5′-GCCCTCCAGCCTGATCTTTT-3′，下游 5′-CAGCGTTATTCCCCAGACCA-3′。检测PVT1 mRNA的相对表达量。

1.6 ECM相关蛋白表达检测 采用Western blot法，检测ECM相关蛋白FN、TGF-β1及PAT-1蛋白的表达。各组细胞培养48 h时，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。上样量为20 μg 总蛋白，经5%的浓缩胶和6%的分离胶SDS-PAGE电泳；浓缩胶60 V电泳60 min，分离胶120 V电泳70 min。湿转法转膜100 V，60 min，5%BSA封闭60 min，免疫抗体反应(稀释比例，一抗 1∶1 000；二抗1∶5 000)。ECL化学发光，医用X光底片显影。使用Quantity One分析电泳条带的灰度值，与GAPDH比较计算相对表达量。

2 结果

2.1 各组不同时间细胞增殖率比较 高糖组细胞各时点细胞增殖率均高于正常对照组，高糖+PVT1 siRNA组各时点细胞增殖率均低于高糖组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间细胞增殖率比较

注：与正常对照组比较，#P<0.05，△P<0.01；与高糖组比较，*P<0.05，▲P<0.01。

2.2 各组细胞周期比例比较 与正常对照组比较，高糖组细胞G1期比例减少、S期比例增多；与高糖组比较，高糖+PVT1 siRNA组细胞G1比例增加、S期比例减少(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞周期比例比较

注：与正常对照组比较，△P<0.01；与高糖组比较，*P<0.05，▲P<0.01。

2.3 各组细胞PVT1 mRNA表达比较 正常对照组、高糖组、高糖+control siRNA组、高糖+PVT1 siRNA组PVT1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.03、7.73±0.06、7.12±0.10、1.92±0.05，高糖组、高糖+control siRNA组PVT1 mRNA相对表达量均高于正常对照组，高糖+PVT1 siRNA组PVT1 mRNA相对表达量低于高糖组(P均<0.05)。

2.4 各组细胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表达比较 高糖组、高糖+control siRNA组、高糖+PVT1 siRNA组FN、TGF-β1、PAT-1表达均高于正常对照组，高糖+PVT1 siRNA组FN、TGF-β1、PAT-1表达均低于高糖组(P均<0.05)。见表3、图1。

表3 各组细胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表达比较

注：与正常对照组比较，△P<0.01；与高糖组比较，*P<0.05，▲P<0.01。

注：1为正常对照组；2为高糖组；3为高糖+control siRNA组；4为高糖+PVT1 siRNA组。

图1 各组细胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表达情况(Western blot法)

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病引起的严重和危害较大的一种慢性并发症，是终末期肾病患者的主要死因之一。糖尿病肾病的发生和发展主要由遗传易感性及高糖环境因素相互作用引起的。高血糖可改变肾小球内血流动力学，促进肾脏ECM沉积。糖尿病肾病在早期可因糖尿病微血管病变导致肾小球滤过功能亢进，而在后期可发生ECM积聚和肾小球硬化，其中肾小球系膜细胞发挥了中心作用[8]。近年研究发现，lncRNA与慢性肾脏疾病的发病有关。Lorenzen 等[9]研究发现，在急性肾损伤危重患者血液中可检测到lncRNA Tap SAKI，且其水平与疾病的严重程度相关。Sui等[10]通过基因芯片分析发现，非IgA原发性肾小球疾病患者系膜区系膜细胞lncRNA明显增多。但目前，lncRNA在肾脏疾病中的研究主要集中在检测其表达差异，而其作用机制研究相对较少。

PVT1位于人染色体8q24，参与该部位以及2、22号染色体之间的复发性易位，参与细胞周期、细胞凋亡和细胞转化重要进程[11]。Hanson等[11]研究发现，PVT1位点与2型糖尿病的发病显著相关，PVT1是终末期肾病的易感基因部位。PVT1与1型糖尿病引起的终末期肾病有关。研究表明，PVT1可导致肾小球ECM沉积。本研究发现，高糖组PVT1 mRNA相对表达量均高于正常对照组，结合高糖组细胞增殖率高于正常对照组、S期细胞比例增多的结果，考虑高糖环境下，肾小球系膜细胞的增殖明显加快，可能与PVT1表达增加有关；高糖+PVT1 siRNA组PVT1 mRNA相对表达量低于高糖组，结合高糖+PVT1 siRNA组细胞增殖率低于高糖组、S期比例减少的结果，考虑抑制PVT1表达后，可明显抑制高糖环境下肾小球系膜细胞的增殖。

ECM是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面和细胞之间的大分子，主要是多糖、蛋白或蛋白聚糖。ECM不属于任何细胞，其决定结缔组织的特性，为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、迁移、增殖和分化。ECM积聚是糖尿病肾病的特点之一。高糖可引起纤溶酶原激活物抑制物过度表达，纤溶酶原转变纤溶酶受抑制，ECM降解减少，导致肾小球硬化、肾脏纤维化。肾小球系膜细胞功能紊乱，分泌大量的细胞因子，包括TGF-β1、FN、COL4A1、PAI-1等ECM合成成分。TGF-β1在ECM作用主要是增加基质合成，此外，TGF-β1可通过抑制MMPs和促进TIMPs的合成，直接影响ECM的表达[13]。TGF-β1表达增加时，可刺激肾小球系膜细胞内蛋白多糖、胶原和纤维连接蛋白的产生，引起ECM合成增加。FN主要是促使细胞与基质结合，使ECM形成网络；或与细胞表面的受体结合，使细胞附着于ECM上，并通过膜整合蛋白将细胞外与细胞内连成一个整体。PAI-1可激活多种蛋白溶解酶，降解ECM、基底膜；促进uPA-uPAR的细胞降解内吞，防止ECM降解过度。ECM蛋白的关键调控因子PAI-1表达升高时，可破坏系膜细胞产生纤维蛋白诱导的能力，使ECM降解缓慢，系膜增生。本研究发现，高糖组FN、TGF-β1、PAT-1表达均高于正常对照组，提示高糖环境下，肾小球系膜细胞中的TGF-β1、FN、PAI-1蛋白表达增加，可能参与了肾小球系膜细胞增殖的过程；高糖+PVT1 siRNA组FN、TGF-β1、PAT-1表达均低于高糖组，提示抑制PVT1表达后，FN、PAI-1、TGF-β1蛋白表达均降低，可能与高糖环境下肾小球系膜细胞增殖受到抑制有关。

综上所述，高糖环境可明显促进肾小球系膜细胞的增殖，且ECM相关蛋白表达增加，可能是导致ECM积聚的机制之一；抑制PVT1表达后，肾小球系膜细胞增殖受到抑制、ECM相关蛋白表达减低，表明下调PVT1表达可通过抑制肾小球系膜细胞增殖及ECM积聚，减缓或抑制糖尿病肾病的发生发展。