围产期高脂高糖孕鼠NP暴露对仔鼠肥胖的影响及机制探讨

李文梅，俞捷，罗娅，王攀，杨雪松，杨静，许洁

(1遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义563099；2遵义医学院附属医院)

肥胖已成为全球性公共卫生问题，可促进多种慢性疾病发生发展，是导致心脑血管疾病、2型糖尿病发病的重要原因之一[1]。诸多研究认为不良生活方式是导致肥胖的主要原因，近年来研究发现，暴露于环境内分泌干扰物(EDCs)中也可导致脂肪形成和肥胖发生，特别是在胎儿及婴幼儿等发育关键时期，机体对激素活性的化学物质较敏感，易受其毒害作用；另外胎儿和新生儿代谢率高于成年人，使得新生儿和儿童对EDCs接触越早、影响越大[2～4]。壬基酚(NP)是EDCs的代表物，与雌二醇结构相似，具有雌激素效应和生物毒性作用，对生物体产生的不良作用包括对内分泌系统、生殖系统和免疫系统的影响及促癌作用等[5]。目前，NP在工业中用作洗涤剂、乳化剂和润湿剂的重要原料，并且在油漆、杀虫剂和家用化妆品中发现[6]。随着环境污染的加重，在人脂肪、乳汁、尿液[7]中均可检测出NP，母体暴露可通过胎盘和母乳使胎儿或新生儿接触NP影响生长发育[8,9]。研究表明，NP与肥胖发生及脂肪形成有相关性，但其主要机制尚未阐明。饱和脂肪摄取过量是当代孕妇最普遍的不良饮食习惯[10]。母体的环境暴露导致体内的毒物高负荷，以及高脂高糖饮食后血脂等升高，可通过胎盘、乳汁等途径传递给子代，影响子代脂代谢。2013～2015年，我们对围产期高糖高脂孕鼠进行NP暴露，观察子代血脂水平、体质量、脂肪质量和脂肪系数、脂肪生成和脂肪细胞分化基因、肝脏和脂肪病理变化，探讨在母鼠围产期高脂高糖饮食基础上NP暴露对仔鼠肥胖发生的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、材料及仪器 清洁级健康未受孕的SD大鼠雌性40只、雄性20只，体质量170～240 g，购于第三军医大学动物中心；99%NP购自东京化成株式会社；饮水为Spring系列实验室纯水系统所制纯水；普通饲料和高脂高糖饲料(配方为15%猪油，20%白糖，65%基础饲料)于上海斯莱克实验动物有限责任公司购买；全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；C-5050光学显微镜(日本Olympus公司)；电子分析天平(上海精科天平仪器厂)；DK-98-Ⅱ数显水浴恒温水浴锅(天津泰斯特公司)；TDL-S离心机(上海安亭公司)；酶标仪(美国Bio Rad公司)。

1.2 分组方法 适应性饲养1周后，以雌雄大鼠2∶1的比例合笼进行交配，次日早晨检查雌鼠，以阴栓或阴道涂片检查到大量精子且处于动情期的雌鼠定为妊娠0 d，收集交配成功的孕鼠。随机分为4组，即普通饲料对照组(OC组)、高脂高糖饲料对照组(HC组)、高脂高糖饲料+NP低剂量组(HNL组)、高脂高糖饲料+NP高剂量组(HNH组)，每组10只孕鼠。OC组食用普通饲料，其余三组均食用高脂高糖饲料，以75 g/(kg·d)进食干饲料进行分笼投食。

1.3 NP干预方法 从母鼠受孕第6天到产后第21天，OC组、HC组孕鼠均予玉米油0.5 mL/(kg·d)灌胃，HNL组、HNH组分别予NP 50、100 mg/(kg·d)灌胃，灌胃直至产后21 d断乳时。仔鼠出生后正常进行母乳喂养，断乳后均以普通饲料喂养至70 d。

1.4 仔鼠血脂水平测定 干预70 d结束后，空腹12 h后用10%水合氯醛麻醉，取仔鼠腹主动脉血，离心取血清，采用全自动生化分析仪检测血清TG、TC、HDL及LDL水平。

1.5 仔鼠体质量、脂肪质量及脂肪系数测定 取血前称仔鼠体质量。取血后取仔鼠性腺旁脂肪垫，用生理盐水洗净血液、滤纸吸干水分，电子天平称仔鼠脂肪质量，计算脂肪系数=脂肪质量(g)/体质量(g)×100%。

1.6 仔鼠肝脏组织中脂肪细胞分化基因检测 仔鼠剖杀后取肝脏组织，采用Real time PCR法检测调控脂肪细胞分化的关键基因转录调节因子(CEBP-α)、固醇调节结合蛋白(SREBP-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)mRNA的表达。

1.7 仔鼠肝脏细胞、脂肪细胞形态观察 取仔鼠肝脏组织和性腺旁脂肪组织，固定于4%的多聚甲醛溶液，石蜡切片后行HE染色，光镜下观察仔鼠肝脏细胞和脂肪细胞形态。

2 结果

2.1 各组仔鼠血脂水平比较 HC组、HNL组、HNH组血清TG、TC、LDL均高于OC组(P均<0.01)。HNL组、HNH组血清TG、TC、LDL均高于HC组(P均<0.01)。HNH组血清TG、TC、LDL均高于HNL组(P均<0.01)。见表1。

表1 各组仔鼠血脂水平比较

注：与OC组比较，*P<0.01；与HC组比较，﹟P<0.01；与HNL组比较，△P<0.01。

2.2 各组仔鼠体质量、脂肪质量及脂肪系数比较 HC组、HNL组、HNH组体质量、脂肪质量、脂肪系数均高于OC组(P均<0.01)。HNL组、HNH组体质量、脂肪系数均高于HC组，HNH组脂肪质量高于HC组(P均<0.01)。HNH组体质量、脂肪质量、脂肪系数均高于HNL组(P均<0.01)。见表2。

2.3 各组仔鼠肝脏组织中CEBP-α、SREBP-1、PPARγ mRNA表达比较 HNH组CEBP-α mRNA表达高于OC组(P<0.01)。HC组、HNH组SRE-BP-1 mRNA表达均高于OC组，HNH组的SREBP-1mRNA表达均高于HC组，HNH组的SREBP-1 mRNA表达高于HNL组(P均<0.01)。HC组、HNL组、HNH组PPARγ mRNA表达均高于OC组，HNH组PPARγ mRNA表达高于HC组，HNH组PPARγ mRNA表达高于HNL组(P均<0.01)。见表3。

表2 各组仔鼠体质量、脂肪质量及脂肪系数比较

注：与OC组比较，*P<0.01；与HC组比较，﹟P<0.01；与HNL组比较，△P<0.01。

表3 各组仔鼠肝脏组织中CEBP-α、SREBP-1、PPARγ mRNA表达比较

注：与OC组比较，*P<0.01；与HC组比较，﹟P<0.01；与HNL组比较，△P<0.01。

2.4 各组仔鼠肝脏细胞变化 OC组肝脏细胞未见脂肪变性和脂滴，HC组可见部分肝脏细胞脂肪变性，HNL组可见大量肝细胞脂肪样变，HNL组可见肝细胞广泛气球样变和大量脂滴。见图1。

2.5 各组仔鼠脂肪细胞变化 OC组细胞大小均匀，未见明显增大。HC组部分脂肪细胞面积增大，HNL组大部分脂肪细胞面积明显增大，HNH组脂肪细胞增大的数目不仅增多，而且细胞面积最大。见图2。

3 讨论

肥胖发病率持续增加已成为全球公共卫生的挑战。母体妊娠期不良饮食习惯易通过胎盘和母乳等方式影响子代脂代谢。目前NP作为增塑剂广泛各种塑料制品中，是洗涤剂、乳化剂和润湿剂的重要原料，存在于油漆、杀虫剂、生活用品和化妆品中，致使长江[11]、大连河口[12]、海河、渤海湾和珠江三角洲河口水样和沉积物中均能检测到NP[13]，与世界其他河口地区相比较，已达到中等污染水平[14]，在地表水、雪和大气沉积中可检测出NP[15]。因此，对母体妊娠期EDCs暴露联合不良饮食习惯是否会增加子代肥胖风险进行研究，对于预防新生儿肥胖具有重要意义。

研究发现，围产期NP暴露可增加子代体质量、脂肪量、血清总胆固醇和葡萄糖水平[16]。NP可通过胎盘屏障或母乳喂养进入胎儿或新生儿体内，模拟雌激素作用对机体代谢稳态进行破坏，导致脂代谢平衡紊乱。低浓度的NP即可诱导脂肪细胞分化，影响甘油-3-磷酸脱氢酶活性和PPARγ的表达以及其脂肪形成所需的靶基因[16]，诱导脂肪组织中的永久性改变[17]，从而影响后代脂肪生成，使瘦素水平显著升高，脂肪细胞数量和大小增加，干扰脂肪形成的关键调节剂和脂肪组织的脂肪生成途径的基因表达，导致子代肥胖的发生[18]。本研究发现，HC组、HNL组、HNH组仔鼠血清TG、TC、LDL水平及体质量、脂肪质量、脂肪系数均高于OC组，HNL组、HNH组血清TG、TC、LDL体质量、脂肪系数均高于HC组，提示围产期高脂高糖饮食及NP均可使仔鼠血脂水平、体质量、脂肪系数增高，且围产期暴露NP后可进一步增高仔鼠的血脂水平、体质量、脂肪系数，进而促进子代肥胖的发生；HNH组脂肪质量高于HC组，提示围产期NP暴露可使仔鼠脂肪组织成分增加。

注：A为OC组；B为HC组；C为HNL组；D为HNH组。

图1 各组肝脏细胞形态表现(HE染色，×200)

注：A为OC组；B为HC组；C为HNL组；D为HNH组。

图2 各组脂肪细胞形态表现(HE染色法，×100)

CEBP-α、SREBP-1、PPARγ作为糖脂质代谢的三个关键基因，参与脂代谢调节过程。CEBP-α基因是第一个被证明在脂肪细胞分化过程中起重要作用的转录因子，脂肪细胞的分化过程中必须要有CEBP-α，干扰CEBP-α基因后可使脂肪组织发育停滞。SREBP-1是一种在新生脂肪生成和糖酵解途径中调节的关键转录基因，在肥胖患者中SREBP-1的水平显著升高。PPARγ作为脂肪细胞主要转录因子可控制脂质储存和动员，激活调节脂质体内平衡，在非脂肪组织中增加游离脂肪酸循环水平和脂质积累。本研究发现，HNH组的CEBP-α基因表达高于OC组，提示高脂饮食及NP可致CEBP-α基因的表达增加；HC组、HNH组的SREBP-1表达均高于OC组,HNH组的SREBP-1表达均高于HC组,HNH组的SREBP-1表达高于HNL组，提示高脂和NP可致大鼠肥胖相关SREBP-1的表达量增加；HC组、HNL组、HNH组的PPARγ均高于OC组，HNH组PPARγ表达高于HC组，HNH组的PPARγ表达高于HNL组，提示高脂饲料和NP可致PPARγ的表达量增加，而且随着NP的染毒剂量增加其PPARγ的表达量增加。镜下观察肝脏和脂肪组织的病理性改变作为诊断机体脂肪量是否增加具有重要意义，本研究对仔鼠肝脏细胞镜下观察时发现，HNH组仔鼠出现肝细胞广泛脂肪样变范围明显多于HNL组肝细胞；对性腺脂肪细胞观察发现，HNH组的脂肪细胞相对HNL组脂肪细胞面积进一步增大，而且数目增多。

综上所述，围产期高脂高糖孕鼠NP暴露可增加仔鼠的体质量和脂肪质量，促进血脂代谢紊乱，其机制可能与NP导致脂肪细胞分化基因CEBP-α、SREBP-1、PPARγ表达异常有关。因此建议围产期妇女应尽量少接触含有NP的物品，如油漆家装、杀虫剂、塑料制品、化妆品等，以避免NP对胎儿生长发育的影响。