5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羟基金刚烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺的合成及其抗肿瘤活性

石 磊, 牛亚慧, 兰作平, 唐 倩, 曾 雪

(重庆医药高等专科学校，重庆 401331)

·制药技术·

5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羟基金刚烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺的合成及其抗肿瘤活性

石 磊, 牛亚慧*, 兰作平, 唐 倩, 曾 雪

(重庆医药高等专科学校，重庆 401331)

以乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯和对氟苯乙酮为起始原料，设计并合成了新化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羟基金刚烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺(7)，其结构经1H NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。采用MTT法测定了其对人乳腺癌细胞(Bcap-37)、人宫颈癌细胞(HeLa229)、人肝癌细胞(QGY-7701)和人肺癌细胞(A549)体外抗肿瘤细胞的增殖活性。结果表明：7对受试细胞的抑制活性较好，其IC50值分别为23.9 μmol·L-1， 29.8 μmol·L-1， 31.4 μmol·L-1和21.7 μmol·L-1。

乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯; 对氟苯乙酮; 吡唑并[1,5-a]嘧啶; 金刚烷; 合成; 抗肿瘤活性

吡唑并[1,5-a]嘧啶类化合物具有广泛的生理和生物活性，据文献报道，可用作抗血吸虫药、黄嘌呤氧化酶抑制剂和ALS酶合成抑制剂[1-2]，而不同取代基位置、不同活性基团取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶类化合物已被化学家关注已久[3]。大量研究表明，吡唑作为一类结构特殊的氮杂环

Scheme 1

也具有多种药理活性[4]，如抗肿瘤[5]、抗菌[6]和抗炎[7]等。近年来，上述两类化合物受到了研究人员的广泛关注和研究[8]。

美金刚胺是一种N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)受体拮抗剂，用于阿尔茨海默病(AD)治疗的代表药物，已被FDA批准上市，在美国一直用于重度AD及血管性痴呆的治疗。已有研究表明，该类药物还对神经组织的肿瘤生长有抑制作用，如神经细胞瘤和神经胶质瘤[9]。

抗代谢类抗肿瘤药的设计与合成方法主要为：对核苷酸碱基部分进行化学修饰或官能团转换[10]。以利用拼合原理将金刚烷胺和吡唑并[1,5-a]嘧啶的母核进行连接，得到新型化合物，以期能够具有两个活性基团的共同活性，为后续药物开发提供新型先导化合物做出基础贡献，为新药研究打下坚实基础。

本文以乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯(1)和对氟苯乙酮(3)为起始原料，制得中间体5-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(2)和1-对氟苯基-4,4,4,-三氟丁二酮(4)；在乙酸回流条件下，2与4经缩合反应制得5-(4-氟苯基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(5)； 5经水解制得5-(4-氟苯基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(6)[11]； 6与3-羟基金刚烷胺经缩合反应合成了新化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羟基金刚烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺(7)，其结构经1H NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。采用MTT法测定了化合物对人乳腺癌细胞(Bcap-37)、人宫颈癌细胞(HeLa229)、人肝癌细胞(QGY-7701)和人肺癌细胞(A549)体外抗肿瘤细胞的增殖活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X24型数字显微熔点仪；AVANCE-600型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标); Spcetrum one型红外光谱仪(KBr压片)；MicroTMQ TOF型高分辨质谱仪；Sheidon CO2型恒温培养箱；SW-CJ-1D型超净工作台；BIO-RAD型酶标仪。

Bcap-37， HeLa229， QGY-7701和A549， ATCC细胞库；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，上海朝瑞生物科技有限公司；RPMI-1640培养基，北京赛因坦科技有限公司；胰蛋白酶，北京赛因坦科技有限公司；其余所用试剂均为化学纯或分析纯。

1.2 合成

(1) 2的合成

在反应瓶中依次加入1 68.00 g(0.40 mol)和无水乙醇200 mL，搅拌使其溶解；缓慢滴加水合肼30.00 g(0.60 mol)，滴毕，缓慢升温至80 ℃，反应4 h。减压蒸除乙醇，剩余物置冰箱静置过夜，析出淡黄色固体，过滤，滤饼用少量冷乙醇洗涤，干燥得淡黄色固体2 41.68 g，收率66.78%。

(2) 4的合成

在反应瓶依次加入甲苯100 mL，无水乙醇16.56 g(0.36 mol)和金属钠8.28 g(0.36 mol，切碎)，搅拌下于室温反应1 h(出现白色粉末，且无金属钠剩余)；冷却，加入3 41.40 g(0.30 mol)和三氟乙酸乙酯51.12 g(0.36 mol)，于60 ℃反应6 h。减压蒸除甲苯，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，萃取液依次用水洗涤、无水硫酸钠干燥，减压蒸除乙酸乙酯，置冰箱中静置过夜，析出白色固体，过滤，干燥得白色固体4 51.245 g，收率73.00%。

(3) 5的合成[12]

在改良的反应合成炉中依次加入2 15.50 g(0.10 mol), 4 23.40 g(0.10 mol)和冰乙酸50 mL，搅拌使其溶解；升温至115 ℃，反应2 h。冷却至室温，静置过夜(析出黄绿色针尖状固体)，过滤，固体用少量冷冰乙酸洗涤，干燥得黄绿色针尖状固体5 27.05 g，收率76.63%;1H NMRδ： 1.36(t,J=7.2 Hz, 3H, CH3), 4.34(q,J=7.2 Hz, 2H, CH2), 7.45(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.37(s, 1H, 6-H), 8.48(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.75(s, 1H, 2-H)； IRν: 3 480, 3 265, 1 697, 1 634, 1 594, 1 570, 1 466, 1 397, 1 327, 1 198, 1 171, 1 027, 848, 778 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H11N3O2F4{[M+Na]+}376.785 6, found 376.785 5。

(4) 6的合成

在反应炉加入5 20.202 g(57 mmol)和NaOH 5.6 g(140 mmol)的乙醇(80 mL)溶液，搅拌使其溶解；缓慢升温至65 ℃，反应1 h。冷却至室温，反应液倒入冰水混合物(300 mL)中，用盐酸调至pH 2，搅拌15 min(析出乳白色固体)，过滤，滤饼用适量乙腈重结晶得乳白色固体6 8.748 g，收率47.03%；1H NMRδ：7.26(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH)， 8.32(s, 1H, 6-H)， 8.52(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH)，8.84(s, 1H, 2-H)， 10.85(s, H, OH)； IRν： 3 435, 1 697, 1 633, 1 595, 1 567, 1 466, 1 398, 1 384, 1 328, 1 256, 1 198, 1 170, 1 158, 938, 846, 778 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H7N3O2F4{[M+Na]+}348.462 1, found 348.462 2。

(5) 7的合成

在反应瓶中依次加入6 1.000 g(3.08 mmol), 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)1.182 g(6.18 mmol), 4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.385 g(3.08 mmol), 1-羟基苯并三唑(HOBT)0.415 g(3.08 mmol)和3-羟基金刚烷胺0.835 g(5.00 mmol)，封闭，抽真空，通氮气，反复三次，氮气保护下，依次加入干燥无水THF 10 mL和无水DMF 30 mL，升温至40 ℃，反应1 h。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，萃取液依次用水洗涤、无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物用少量乙酸乙酯/正己烷混合液洗涤,干燥得淡黄色固体7 1.162 g，收率79.47%;1H NMRδ: 1.64(m, 12H, adamantine-CH2), 2.49(s, 2H, adamantine-CH), 4.61(s, 1H, adamantine-OH), 7.48(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 7.87(s, 1H, 6-H), 8.32(s, 1H, 2-H), 8.39(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.63(s, 1H, NH)； IRν： 3 446, 3 341, 2 924, 2 856, 1 654, 1 600, 1 571, 1 551, 1 515, 1 402, 1 332, 1 286, 835, 774 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N4O2F4{[M+Na]+}497.283 4, found 497.283 3。

1.3 抗肿瘤活性测定

取选定的处于对数生长期的肿瘤细胞株，加入胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基配制为每个细胞悬液(4 000个/mL)并接种于96孔培养板，每孔100 μL。置于37 ℃， 5%CO2培养箱中培养24 h。化合物用DMSO溶解，并且用培养液稀释成不同浓度(40.00 μmol·L-1, 20.00 μmol·L-1, 10.00 μmol·L-1, 5.00 μmol·L-1, 2.50 μmol·L-1)，在培养板中加入上述溶液作为实验组。每组都各设3个平行孔，同时用顺铂作为对照组。相同条件下培养24 h，每孔中加入MTT(5 mg·mL-1MTT的磷酸盐缓冲液)10 μL，继续保温4 h，吸去各孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μL。振荡15 min，使得形成澄清溶液，用酶标仪测定波长490 nm处的OD值[13]，实验重复3次，用软件spss21.0计算化合物的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 2的合成条件优化

为了获得2的最佳合成条件，对反应条件进行了优化，分别考察了反应温度和反应时间对2收率的影响。

(1) 反应温度

1 0.40 mol，其余反应条件同1.2(1)，考察反应温度对收率的影响，结果见表1。由表1可知，随着反应温度升高，收率逐渐提高，温度80 ℃，收率为66.78%,继续提高反应温度，收率增加的幅度较小，而且杂质比较多，粗产物经结晶后所得产物较少，且纯度降低。故反应温度为80 ℃较佳。

(2) 反应时间

反应温度为80 ℃，其余反应条件同2.1(1)，考察反应时间对收率的影响，结果见表2。由表2可知，反应初始阶段速度较慢，当反应进行到4 h后已基本完成，收率66.78%,继续延长反应时间，收率略有增加，但反应液颜色明显加深，说明有杂质产生；同时增加了反应成本，故反应时间控制在4 h较适宜。

表1 反应温度对收率的影响

表2 反应时间对收率的影响

2.2 7的合成条件优化

本文还对7的反应条件进行了优化，分别考察了溶剂用量和原料配比[r=n(6)∶n(3-羟基金刚烷胺)]对其收率的影响。

(1) 溶剂用量

在反应中，为了降低成本，减少对操作者和环境的危害，用THF和DMF作为溶剂。保持其他条件相同，考察THF和DMF用量对产品收率的影响，结果见表3。由表3可以看出，DMF有利于反应物的溶解，并且有利于形成溶液，加速反应的进行，使得反应的产率提高，最终确定THF/DMF(V/V=1/3)为反应溶剂。

(2)r

进一步考察r对收率的影响，结果见表4。由表4可知，增加3-羟基金刚烷胺的量，有利于收率提高，当r达到1 ∶1.3时，收率最高(79.47%)，继续增加3-羟基金刚烷胺用量，收率基本不变，还造成原料浪费，给后续处理工作带来麻烦。因此r为1 ∶1.3较佳。

表3 溶剂用量对收率的影响

表4 r对收率的影响

2.3 抗肿瘤活性

化合物的抗肿瘤活性结果见表5。由表5可见，在体外活性试验中，目标产物7对肿瘤细胞Bcap-37， HeLa229， QGY-7701和A549均有一定的抑制作用，其IC50值分别为23.9 μmol·L-1， 29.8 μmol·L-1， 31.4 μmol·L-1和21.7 μmol·L-1。相比较之下，中间体5和6的抗肿瘤细胞生长的活性较低，但是可以作为先导化合物进一步研究，开发出更多的活性化合物。

表5 化合物的抗肿瘤活性

利用经过改进的合成炉首次合成了结构新颖的化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羟基金刚烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺。该方法效率较高，产物纯度较高，后处理简单。该方法利用常见的化学试剂、原料和合成方法，将两个活性基团连接在一起，体外活性实验中发现，目标产物对肿瘤细胞的生长抑制活性很好，期望在后期的体内活性实验中，两个活性单元会在体内水解，分别发挥其药理作用，为后续的深入研究提供理论基础。另外所涉及的两个中间体化合物也体现出一定的研究价值，因其可以与很多活性基团进行结合形成新的化合物，可能展现出较好的生物活性，将作为后期研究的重点。

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告 作 者

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《合成化学》编辑部

Synthesis and Antitumar Activities of 5-(4-Fluorine phenyl)-N-1-(3-hydroxyl-adamantaneyl)- 7-trifluoromethyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-amide

SHI Lei, NIU Ya-hui*, LAN Zuo-ping, TANG Qian, ZENG Xue

(Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China)

The novel compound, 5-(4-fluorine phenyl)-7-trifluoromethyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine, was designed and synthesized using ethyl (ethoxymethylene)cyanoacetate and 4′-fluoroacetophenone as the starting materials. The sturcture was characterized by1H NMR , IR and HR-MS(ESI). Theinvitroantitumar activities of 7 against human breast cancer cells(Bcap 37), human cervical cancer cells(HeLa229), human liver cancer cells (QGY-7701) and human lung cancer cells(A549) were investigated by MTT method. The results indicated that 7 showed good inhibition activities with IC50of 23.9 μmol·L-1, 29.8 μmol·L-1, 31.4 μmol·L-1and 21.7 μmol·L-1, respectively.

ethyl (ethoxymethylene)cyanoacetate; 4′-fluoroacetophenone; pyrazolo[1,5-a] pyrimidine; adamantane; synthesis; antitumar activity

2016-09-18；

2017-01-18

重庆医药高等专科学校自然科学重点项目(ygz2015102)

石磊(1987-)，男，汉族，黑龙江哈尔滨人，硕士，讲师，主要从事有机化学和药物化学的研究。 E-mail: 383814843@qq.com

牛亚慧，讲师， Tel. 023-61969052, E-mail: 48405489@qq.com

O626.4; R914.5

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16236