内部核糖体进入位点介导核糖体翻译起始机制

马 鹏，周小凯，常秋燕，李林杰，马晓霞，马忠仁*

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)



内部核糖体进入位点介导核糖体翻译起始机制

马 鹏1,2，周小凯1,2，常秋燕1,2，李林杰1,2，马晓霞1,2，马忠仁1,2*

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

部分正链RNA病毒基因的蛋白质合成是由其自身的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site, IRES)以非依赖5’甲基化帽状结构来实现的。目前，IRES被分为4类，虽然这4类IRES在对其介导的基因合成目的蛋白的机制不同，但是这些不同蛋白翻译机制是依赖IRES与不同真核翻译起始因子相互作用形成特定的复合物来实现的。真核生物翻译是由起始tRNA(Met-tRNAMeti)/eIF2·GTP三元复合物引发，与翻译因子和40S小亚基结合形成43S复合物，43S复合物在eIF1A协助下与起始密码子结合形成48S复合物，在eIF5·GTP促进下60S亚基与40S亚基结合形成80S核糖体。IRES介导翻译通过eIF4G、IRES与eIF4A结合引导43S复合物与IRES结合。Ⅲ型IRES在无eIF3的参与下与40S小亚基的E位点结合并与eIF2·GTP/initiator tRNA形成48S亚基，在eIF5/eIF5B的调控下与60S亚基形成活化的核糖体进行蛋白质翻译。

核糖体；内部核糖体进入位点；蛋白质翻译起始；Ⅲ型内部核糖体进入位点

细胞内蛋白质的翻译一般分为3 步, 即起始、延伸和终止。许多真核病毒mRNA的翻译起始是由其自身的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site, IRES)以非依赖5’甲基化帽状结构的翻译机制来进行。 1988年，Pelletier等发现脊髓灰质炎病毒的5’端非翻译区长约450个核苷酸的P2序列可以指导真核mRNA的翻译；同年Jang等发现脑心肌炎病毒5’端非翻译区的一段序列能够指导内部核糖体进入从而起始翻译。1991年，Macejak等发现在细胞免疫球蛋白重链结合蛋白基因的5’-UTR中存在IRES元件。1995年，Chen和Sarnow在体外构建了环状mRNA，证明了IRES可以在环状mRNA中指导蛋白合成，说明了此时蛋白的翻译的确是特异性地依赖于IRES序列。

根据IRES功能的差异，将IRES分4类，即Ⅰ型(以脊髓灰质炎病毒为代表)、Ⅱ型(以心脑病毒为代表)、Ⅲ型(以丙肝病毒为代表)[1]和Ⅳ型(以蟋蟀麻痹病毒为代表)[2]。据研究表明4种IRES是以不同的方式来介导蛋白质翻译的起始，但是这些翻译起始机制都需要真核细胞内的翻译元件如真核翻译起始因子和核糖体40S小亚基等。目前对Ⅲ型和Ⅳ型IRES进行结构和生物化学方面的研究发现了这两种IRES元件影响翻译起始的共同特点，即通过IRES元件自身来诱导核糖体拓扑结构发生改变，进而影响mRNA在识别核糖体翻译孔道过程中的进入、定位和固定。同时，能加强起始tRNA在40S小亚基P位点的稳定性，启动翻译起始复合物在蛋白质合成的下游事件[3]，并且诱导亚基组装和在初步新生多肽延伸过程中核糖体的易位。

1 真核生物的翻译起始机制

对于大多数真核生物的mRNA的翻译起始过程可以利用扫描模型来进行阐述，这种扫描模型包括两个阶段，即48S复合物的形成，随后亚基加入形成80S核糖体。基因的翻译起始由40S和60S亚基组成80S核糖体，这个80S大蛋白形成需要翻译起始因子eIF3、eIF3j、eIF1和eIF1A的相互作用[4]。基因翻译起始的第一步由起始tRNA(Met-tRNAMeti)/eIF2·GTP三元复合物引发，并且通过其与诸多翻译起始因子(eIF3、eIF1和eIF1A)以及40S核糖体小亚基形成43S核糖体翻译初始复合物的互作来实现的。在 eIF4E、eIF4A和eIF4G的作用下，43S复合物结合mRNA 5’端甲基化帽状结构。这种翻译因子的装配机制是通过eIF4F、eIF4A和eIF4B与mRNA 5’端松散的帽状结构相互作用后形成一个结合位点，这使得eIF3、eIF4G、mRNA和40S亚基可以进行组装。43S复合物需要eIF1和eIF1A的协助来进行翻译扫描的下游事件。43S复合物与起始密码子接触时停止扫描并组装成48S复合物。通常当起始密码子未处在Kozak序列这种理想的核苷酸环境中，具有翻译合成功能的核糖体会在对应Kozak序列的-3或+4位越过此处的起始密码子，并且继续扫描此基因内部的AUG来进行相关蛋白的翻译合成。

从43S复合物的扫描形态过渡到48S复合物，对起始密码子的定位形态都需要40S亚基的形态变构，随之与其变构的还有Met-tRNAMeti与mRNA结合的位置以及与其互作的各种翻译起始因子的相对位置[5]。eIF1A占据核糖体A位点，eIF1A的两端(NTT和CTT)延伸到43S复合物的P位点[6]，并与Met-tRNAMeti和P位点之间的eIF1相邻[7]。翻译起始复合物对起始密码子的识别导致eIF1从40S亚基上解离下来[8]，而使eIF1A-CTT偏离P位点，但是这使得eIF1A的折叠区与A位点的结合更加牢固[9]。eIF5·GTP可将40S亚基上的剩余翻译起始因子去除并且促进60S亚基与40S亚基的结合形成80S核糖体[10]。eIF5B的C末端结构域可将与Met-tRNAMeti接受区结合的eIF2置换下来，可使eIF2·GDP从翻译起始复合物中脱落并且实现Met-tRNAMeti的循环利用，同时eIF5B的C末端准确进入60S亚基的P位点使核糖体组装顺利进行。最后，GTP高能磷酸键水解使eIF5B·GDP从翻译起始复合物中释放出来，完整的80S核糖体进入蛋白合成肽链延伸阶段[11]。

2 真核细胞与原核细胞在翻译起始机制方面的比较

真核和原核系统的蛋白质翻译起始机制是相似的，即都是开始于小亚基P位点结合特异性起始tRNA复合物的形成，含有mRNA和tRNA中间体复合物的逐步形成为核糖体大小亚基结合做前期准备[12]。核糖体的核心区是十分保守的，而不同处也只局限在rRNA延伸部位和翻译起始因子在其外围的结合定位[13]。核糖体亚基具有形态学特征，例如“肩部”和平台形态，其与“头部”的连接是通过狭窄的“脖颈”来连接的。在原核翻译系统中，tRNA与P位点的结合可通过30S小亚基多步调节，以确保目标基因通过P位点的每个密码子都能准确按照碱基互补配对原则来进行翻译。原核生物的mRNA在核糖体“脖颈”处的狭缝内与核糖体结合并贯穿于两条未共价闭合隧道中(一条是由核糖体的“头部”和“肩部”形成，另一条由“头部”和平台形成)。mRNA锚定在平台处是通过其起始密码子上的SD序列与16S核糖体rRNA 3’端的反SD序列的互补结合来实现的。SD序列不存在于真核mRNA序列内，但真核mRNA与40S小亚基的结合的机制与原核mRNA与对应核糖体小亚基的结合模式是相似的。

然而，原核翻译系统的翻译起始过程较真核系统的简单。这是因为原核生物mRNA和tRNA可以在IF1、IF2和IF3完全不参与的情况下与30S小亚基结合，而这3种翻译起始因子是增强翻译起始准确性的重要物质基础。IF2是真核翻译起始因子eIF5B的同源物，可加强起始tRNA与30S小亚基的结合，同时在大小亚基结合的过程中IF2可引导自身在接受区末端插入50S大亚基[14]。IF1与真核翻译起始因子eIF1A核心区同源，可与核糖体A位点结合。研究发现与真核翻译起始因子eIF1功能相似的IF3的C末端可以与P位点临近的平台表面结合。IF1和IF3能促进翻译起始的准确性，从而提高了tRNA-mRNA错配复合物从核糖体中的清除能力，这可能是由于因为相关因子通过诱导30S小亚基构象产生变化。eIF1与IF3结合的位点是相似的，并且也参与翻译起始的精确执行。

3 由IRES介导的病毒蛋白质翻译起始

IRES元件是一种具有介导翻译起始功能的RNA元件，这是因为将其插入双顺反子之间会导致下游顺反子独立于上游顺反子进行翻译表达[15]。脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒的IRES是最先被鉴定出来的[16]，这两种长约450nt的IRES分别被划分为Ⅰ型和Ⅱ型。生化重建实验(biochemical reconstitution experiment)表明EMCV的IRES在启动靶基因表达翻译时所利用的翻译起始因子与常规翻译起始机制下采用的蛋白因子是一样的，只是eIF4E和eIF4G的N端参与结合eIF4E的功能区不参与其非依赖5’端甲基化帽状结构翻译起始的过程[17-18]。这些都说明IRES元件在介导蛋白质翻译起始是通过其自身与真核细胞内的各种翻译起始因子之间的特异性互作来实现的。例如，Ⅰ型和Ⅱ型IRES与第一个起始密码子临近，这使得eIF4G 与IRES特异性地结合，而后与eIF4A结合来引导43S复合物与IRES的结合[19]。分别以HCV和CrPV为代表的Ⅲ型和Ⅳ型IRES序列之间存在的差异较大，与Ⅰ型和Ⅱ型相比这种差异也是十分明显的。虽然这4种IRES在介导翻译起始的过程上存在差异，但是有一点是相同的，即他们在介导蛋白质翻译起始都是与40S小亚基在部分翻译起始因子的作用下相互作用[20]。

4 Ⅲ型IRES介导的翻译起始

4.1 Ⅲ型IRES的结构

丙型肝炎病毒(HCV)的IRES是从5’UTR的第40nt到341nt之间的区域，这个区域由3个结构域组成。结构域Ⅱ是一个长而不规律的茎环结构[21]，结构域Ⅲ由假结节、发卡结构中的Ⅲa-Ⅲf亚结构和插入其间的螺旋结构组成，而结构域Ⅳ是一个含有起始密码子的短发卡状结构。对于HCV IRES样亚群来说，他们虽然在结构上有些差别，但是其发挥的功能是相似的。这些IRES元件均含有由一个假结节、亚结构域Ⅲe和亚结构域Ⅲd构成的核心区域。利用化学和酶学足迹法研究发现，核糖体存在多个位点可与HCV结构域Ⅱ的顶端、结构域Ⅲa/Ⅲb/Ⅲc四面的节点、假结节和起始密码子周围核苷酸序列发生互作[22]。冷冻电子显微镜发现HCV IRES以拉伸构型与40S亚基发生亲水性的表面结合，即IRES结构域Ⅲ与核糖体的工作平台区、“躯干”区结合，而结构域Ⅱ与40S亚基的“头”部互作，部分结构将占据E位点并且在mRNA结合裂隙内向P位点延伸[23]。HCV和其含有的IRES所具有的活性均需要一段从IRES结构域Ⅱ的5’端到起始密码子下游40nt的序列。这段特殊序列的任何一点减少都会削弱IRES的功能活性，而这段序列下游的编码区却可以被不会形成特定二级结构的外源基因所替换。与其他IRES亚群一样，HCV和相关病毒IRES内部的螺旋结构也起到支撑整体结构的作用，但是那些保守的单链核苷酸却能直接和细胞内的蛋白翻译调节因子互作[24]。

4.2 Ⅲ型IRES介导翻译起始需要蛋白因子的参与

利用生化重建试验对HCV、猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪捷申病毒(PTV)和SPV9的IRES进行功能分析发现，40S亚基、Met-tRNAMeti和eIF2在48S复合物的形成中十分重要。IRES介导的翻译起始的初期是有非依赖性翻译起始因子的参与，由IRES与40S亚基直接结合启动，这一过程中翻译起始密码子进入P位点附近的区域，并且其下游编码序列嵌合到mRNA结合裂隙内[25]。eIF3在此过程中的参与可以增强48S复合物的稳定性，但eIF3在正常情况下只在核糖体组装阶段与eIF5和eIF5B一起发挥作用。HCV IRES在介导翻译起始的过程中并不需要40S亚基对其序列进行扫描，而是直接在起始密码子处形成48S复合物，并且此过程无需eIF4A、eIF4B、eIF4F、eIF1和eIF1A的参与[26]。类似HCV IRES元件的主要特性是直接且非依赖性与40S亚基和eIF3结合，从而使43S复合物直接与IRES元件结合。但是，另有研究认为，病毒mRNA的编码序列进入40S亚基的mRNA结合裂隙的时候是由在IRES上组装成的43S复合物与eIF2·GTP/Met-tRNAMeti三元复合物结合所产生的调节作用来实现的，但这一过程不需要P位点处发生密码子与反密码子的互配。接下来是Ⅲ型IRES元件介导翻译起始的核糖体组装阶段，这一阶段与标准翻译起始的过程是平行的[27]，需要eIF5裂解eIF2与GTP之间的化学键并且需要eIF5B来调节各种蛋白因子从40S亚基解离和指导大小亚基的结合形成80S核糖体。依赖于eIF2三元复合物与40S亚基稳定结合，eIF3在核糖体组装的过程中多次发挥作用，可使48S复合物的形成效率显著提高。eIF5诱导eIF2-GTP之间的化学键水解断裂后，Met-tRNAMeti增强了其在P位点处的结合能力，这可使40S亚基构象改变以迎合大小亚基组装成80S核糖体[28]。

在HCV IRES介导翻译起始的剩余过程中，有两种可相互交替的机制确保翻译起始在病毒感染细胞的顺利进行。在无翻译起始因子的参与下，具有延伸能力的80S核糖体可以在HCV IRES上高效组装，而处在正常生理水平的Mg2+浓度却限制了组装的效率。然而，CSFV IRES元件可在正常生理水平的Mg2+浓度下在无翻译起始因子的参与下组装80S核糖体。

5 小结

Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型IRES在结构上是不同的，并且以不同的机制介导翻译起始。然而，Ⅲ型和Ⅳ型IRES可直接与核糖体结合，并且所形成的构象是IRES与核糖体通过多个步骤相互作用且诱导核糖体内部构象改变从而在多个阶段调节翻译起始。IRES可在翻译起始的各个阶段改变自身构型和大小亚基的构型。当前，对细胞自身的内部核糖体进入位点(IRES)介导核糖体翻译起始的机制尚未完全清楚，揭示细胞IRES在蛋白翻译中的更多的作用机理，需要对其进行更加深入的探索。随着研究进程，我们终将对细胞中蛋白质的翻译做到更加精准的调控，以期实现为人类服务的目的。

[1] Torrecilla J, Pozo-Rodríguez A D, Solinís M, et al. Silencing of hepatitis C virus replication by a non-viral vector based on solid lipid nanoparticles containing a shRNA targeted to the internal ribosome entry site (IRES)[J].Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2016;146:808-817.

[2] Kerr C H, Ma Z W, Jang C J, et al. Molecular analysis of the factorless internal ribosome entry site in Cricket paralysis virus infection[J].Sci Rerprts,2016,6:37319.

[3] 高荣远,杨德成,孙 超,等.脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力[J].中国预防兽医学报, 2015, 37(11) : 834-837.

[4] Muhs M, Yamamoto H, Ismer J, et al. Structural basis for the binding of IRES RNAs to the head of the ribosomal 40S subunit[J].Nucleic Acids Res,2011,39(12):5264-75.

[5] Hinnebusch A G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation[J]. Ann Rev Biochem,2014,83:779-812.

[6] Zhou J, Lancaster L, Donohue JP, et al. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation[J].Science,2014,345:1188-1191.

[7] Llácer J L, Hussain T, Marler L, et al. Conformational differences between open and closed states of the eukaryotic translation initiation complex[J].Mol Cell,2015,59:399-412.

[8] Aylett C H, Boehringer D, Erzberger J P, et al. Structure of a yeast 40S-eIF1-eIF1A-eIF3-eIF3j initiation complex[J]. Nat Struct Mol Biol,2015,22:269-271.

[9] Fekete C A, Mitchell S F, Cherkasova V A, et al. N- and C-terminal residues of eIF1A have opposing effects on the fidelity of start codon selection[J]. Embo J,2007,26:1602-1614.

[10] Zhou J, Lancaster L, Donohue J P, et al. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation[J].Science,2014,345:1188-1191.

[11] Algire M A, Maag D, Lorsch J R. Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation[J].Mol Cell,2005,20:251-262.

[12] Pestova T V, Lomakin I B, Lee J H, et al. The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B[J]. Nature,2000,403:332-335.

[13] Butcher S E. tRNA-mimicry in IRES-mediated translation and recoding[J].RNA biol, 2016,1-7.

[14] Murray J, Savva C G, Shin B S, et al. Structural characterization of ribosome recruitment and translocation by type IV IRES[J].Elife Sci,2016,5.

[15] Rodnina M V, Wintermeyer W. Recent mechanistic insights into eukaryotic ribosomes[J]. Curr Opin Cell Biol, 2009,21:435-443.

[16] 何金娇,刘雪莹,吴云舟,等.基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究[J].中国预防兽医学报, 2013, 35(6): 485-489.

[17] Carpio T, Aurora S, Mitoma D, et al. Internal ribosome entry site (IRES) from encephalomyocarditis virus (EMCV) as a tool for shuttle expression plasmids[J].Biochem Biophys Res Commun,2015, 468(4): 548-553.

[18] Kamenska A, Simpson C, Standart N. eIF4E-binding proteins: new factors, new locations, new roles[J]. Biochem Soc Trans,2014,42:1238-1245.

[19] Petrov A, Grosely R,Chen J. Multiple parallel pathways of translation initiation on the CrPV IRES[J].Mol Cell,2016,62(1):92-103.

[20] Vaklavas C, Meng Z, Choi H. Small molecule inhibitors of IRES-mediated translation[J].Cancer Biol Thera,2015,16(10):1471-1485.

[21] de Breyne S, Yu Y, Unbehaun A, et al. Direct functional interaction of initiation factor eIF4G with the type 1 internal ribosomal entry site of enteroviruses[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:9197-9202.

[22] Zhao Q, Han Q, Kissinger C R, et al. Structure of hepatitis C virus IRES subdomain IIa[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2008,64:436-443.

[23] Fletcher S P, Jackson R J. Pestivirus internal ribosome entry site (IRES) structure and function:elements in the 5' untranslated region important for IRES function[J]. J Virol,2002,76:5024-5033.

[24] Pisarev A V, Shirokikh N E, Hellen C. Translation initiation by factor-independent binding of eukaryotic ribosomes to internal ribosomal entry sites[J]. C R Biol,2005,328:589-605.

[25] de Breyne S, Yu Y, Pestova T V, et al. Factor requirements for translation initiation on the Simian picornavirus internal ribosomal entry site[J]. RNA,2008,14:367-380.

[26] Chan S W. Hydrogen peroxide induces La cytoplasmic shuttling and increases hepatitis C virus internal ribosome entry site-dependent translation[J].J Gen Virol,2016,97:2301-2315.

[27] Fraser C S, Hershey J W, Doudna J A. The pathway of hepatitis C virus mRNA recruitment to the human ribosome[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16:397-404.

[28] Locker N, Easton L E, Lukavsky P J. HCV and CSFV IRES domain II mediate eIF2 release during 80S ribosome assembly[J]. Embo J,2007,26:795-805.

Internal Ribosomal Entry Site Induced Mechanism of Translation Initiation in the Ribosome

MA Peng，ZHOU Xiao-kai，CHANG Qiu-yan，LI Lin-jie，MA Xiao-xia，MA Zhong-ren
(1.GansuEngineeringResearchCenterForAnimalCell,NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou,Gansu,730030,China;2.CollegeofLifeSciencesandEngineering,NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou,Gansu, 730030,China)

The protein synthesis of RNA viral genes is realized by the internal ribosomal entry site(IRES), which is independent on the 5 'methylation cap structure.At present,IRES is divided into four categories, although the four types of IRES are different in the mechanism of gene synthesis of the target protein.The translation mechanism of these proteins is dependent on the interaction of IRES with different eukaryotic translation initiation factors to form specific complexes.Eukaryotic translation was initiated by the tRNA(Met-tRNAMeti)/eIF2·GTP ternary complex, which binds to the translation factor and the 40S subunit to form a 43S complex that in eIF1A assistance and initiation codon to form 48S complexes.In the end, with eIF5·GTP promoted the formation of 80S ribosome through combination of 60S subunit and 40S subunit.IRES-mediated translation through the combination of eIF4G, IRES and eIF4A guide the combination of 43S complex and IRES.Type 3 IRESs combined in E-sites of 40S subunit without the eIF3,afterwards combined with eIF2·GTP/initiator tRNA constitute a 48S complex. The 48S complex in an eIF5/eIF5B mediated reaction to come into being a 60S subunit which form an active ribosome that can turn on the protein translation.

ribosome; IRES; protein translation initiation; type 3 IRESs

2016-12-02

企业横向项目(XBMu-2015-Bc-11)；中央高校基本科研业务费(1001860564)

马 鹏(1993-)，男，山西大同人，硕士研究生，主要从事病原生物学与动物疫病防治。*通讯作者

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0074-04