A群牛轮状病毒的分子生物学研究进展

李 凡,周 芳, 岳 华,汤 承

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)



A群牛轮状病毒的分子生物学研究进展

李 凡,周 芳, 岳 华,汤 承*

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

牛轮状病毒(Bovine rotavirus, BRV)是犊牛腹泻的重要病原之一，了解病毒的分子结构和功能以及遗传进化，对该病毒的检测方法和防控具有重要意义。论文对近年来在A群BRV的重要结构蛋白和非结构蛋白的分子特征和功能的研究进展做一综述。

牛轮状病毒；分子特征；遗传进化

牛轮状病毒(Bovine rotavirus, BRV)是犊牛腹泻的重要病原之一。1968年Mebus等首次发现了BRV，并证实BRV是引发新生犊牛腹泻的主要病原，并将其定名为NCDV标株毒株[1]。1980年福建畜牧兽医研究所研究证实BRV也存在我国牛群中[2]。牛轮状病毒与其他轮状病毒一样，属于呼肠病毒科轮状病毒属，无囊膜双链RNA病毒，直径大约60 nm～80 nm，是一个对称的20面体，电镜下观察可以看到典型的“车轮状”。RV由3层衣壳构成，分为11个基因阶段，分别编码6种结构蛋白(VP1～VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)，其中VP1～VP3被认为是RV的核心蛋白,是基因转录和复制过程中不可缺少的一种蛋白[3-4]；VP6被称为内衣壳蛋白，是决定RV分组的特异性抗原，具有较强的免疫原性，是RV感染血清抗体检测的重要候选抗原；VP7和VP4蛋白决定RV的G型与P型以及它的毒力；NSP1～NSP6非结构蛋白在轮状病毒的复制、转录、组成病毒复制酶、出芽、等过程中发挥着重要的作用。目前，BRV感染在全球范围内流行，严重威胁着全世界养牛业的快速发展[5-6]，因此有必要加强对BRV的及时监测和防治。本文重点阐述A群BRV的几个重要结构蛋白和非结构蛋白的分子特征及分子检测方法的研究进展。

1 牛轮状病毒重要蛋白的功能及分子特征

2008年Matthijnssens J科研小组通过分析比对GenBank中众多已知的不同RV毒株的每个基因节段编码区核苷酸同源性，为每个基因节段对应的基因型的序列同源性定临界值从而来确定每个毒株的基因型。不同基因节段对应不同的基因型，按照下面的排列顺序对A群轮状病毒进行新的分类和命名VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5，每个基因节段相对应的基因型为Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx，其中x表示被命名的轮状病毒相应的基因型，通过此方法命名RV可直观的观察到病毒基因的重组。而通常以轮状病毒VP4和VP7所决定的基因型来表示其毒株的基因型。迄今为止，已经发现的G型有27个，P型有37个[7]。其中12个G型(G1～G3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21和G24)和 11个P型(P[1]、P[3]、P[5-7]、P[11]、P[14]、P[17]、P[21]、P[29]和P[33])在牛轮状病毒中被发现。其中G6、G8、G10和P[1]、P[5]、P[11]基因型被研究证实在BRV中最常见[8]。

随着牛轮状病毒不断在世界各地被发现，BRV对养牛业的危害越发严重，近年来，对于BRV的研究也不断深入。为了加强对牛轮状病毒的诊断和防治，目前很多学者研究开发预防牛轮状病毒的疫苗，其中VP4 、VP6、VP7这3种结构蛋白成为研究的热点[9]。因为这3种结构蛋白的免疫原性与轮状病毒的抗原特性有重要的关系。由第4节段基因编码的外壳敏感蛋白VP4是轮状病毒的血凝素抗原；由第6节段基因编码的内壳蛋白是轮状病毒的群组抗原；由第7、8或9节段的基因编码的外壳糖蛋白VP7是轮状病毒的中和抗原[10]。另外，NSP4非结构蛋白的一些抗原特性，也为RV疫苗的研制开辟了新的思路和方向[11]。目前，疫苗的研究还处在对RV的主要保护性抗原的结构和功能的研究[12]。

1. 1 VP4结构蛋白的功能及分子特征

1. 1.1 VP4结构蛋白的功能 VP4蛋白由轮状病毒第4节段基因编码，位于成熟的病颗粒表面，可以被胰酶裂解成长度不等的带羧基端的VP5和带氨基末端的VP8两个片段。VP4裂解后能提高轮状病毒的感染能力和穿入细胞的能力，增强轮状病毒的繁殖能力，在胰酶的作用下，就能够促进体外培养细胞的空斑的形成。当轮状病毒入侵宿主细胞时，病毒颗粒必须失去由VP4和VP7形成的双层衣壳，形成转录活性较大的DLP，才能进入到靶细胞的细胞质中。VP4蛋白还可以决定病毒的毒力，被认为是轮状病毒连接宿主细胞受体的病毒蛋白。牛轮状病毒的VP4外壳蛋白能诱导机体产生中和抗原，是病毒的重要保护性抗原之一， 具有良好的免疫原性，能使某些幼龄动物和人的红细胞发生凝集，在不同的型之间还存在交叉保护，是疫苗研究最有前途的蛋白之一[13]。但目前用于BRV的基因工程亚单位疫苗还没有被研制出来。

1.1.2 VP4基因的分子特征及遗传进化分析 VP4的氨基酸序列84-180位点之间为VP8亚单位，是VP4亚型和血清型特异性位点，是VP4基因的主要中和反应位点，并且只需对这一区域测序就可断定VP4所决定的P型[14]。目前已发现的P型达37种，在牛轮状病毒中最常见的P型是[P[1]、P[5]和P[11][8]。在我国BRV分离毒株中，其基因型主要为P[1]、P[11]和P[6]。GenBank中登录的BRV VP4全基因序列共有36个，未明确P型的有7个，确定P型的有29个分为7 种，分别为P[1]型5个、P[5]型6个、P[7]型2个、P[11]型10个、P[14]型4个、P[29]型1个、P[33]型1个。系统发育显示，不同P型分为不同支，相同P型但不同G型的在同一独立的小支上。VP4结构蛋白的氨基酸序列系统发育树结构层次与核苷酸系统发育树一样。把VP4核苷酸序列进行同源性比对分析发现，不同P型之间的VP4基因序列的同源性在58.3%～74.6%之间，相同的P型之间的同源性为85.5%～98.5%；氨基酸序列比对分析表明，不同P型的VP4氨基酸序列的同源性在53.8%～70.6%之间，相同的P型之间的同源性为94.6%～97.8%之间。由此可知，不论核苷酸序列还是氨基酸序列，相同基因型之间高度保守，但不同P型之间VP4的序列却发生了很大的变异。

1. 2 VP6结构蛋白的功能及分子特性

1. 2.1 VP6结构蛋白的功能 根据VP6结构蛋白的抗原性和PAGE电泳图的差异，可以将轮状病毒分为A～G7个群，其中A、B和C群RV易感染牛，A群BRV是引起牛腹泻最常见的一种病毒[15]，对养牛业危害最大。根据VP6蛋白是否存在2个不同的非重叠抗原特异性抗原表位，可以将A组轮状病毒分为4个亚群，分别为SGⅠ亚群、SGⅡ亚群、SGⅠ/Ⅱ亚群和非SGⅠ/Ⅱ亚群。与SGⅠ亚群的抗体相关的抗原表位有172位点的Ala(Alanine，丙氨酸)、299位点的Asn(Asparaginate，天冬氨酸)、305位点的Ala、310位点的Asn。与SG Ⅱ亚群的抗体相关的抗原表位有248位点的Phe(Phenylalanine，苯丙氨酸)、305位点的Asn、306位点的Ala、310位点的Gln(Glutamine，谷氨酰胺)、315位点的Gln。亚群抗原决定簇的氨基酸序列被认为是非连续的，它依赖于蛋白的空间结构[16]。利用VP6蛋白与单克隆抗体的反应性及肽扫描技术合成连续7肽，可以确定A组哺乳动物轮状病毒的VP6蛋白的4个免疫优势位点(32-64、155-167、208-274、380-397)，这是轮状病毒A组共同的抗原决定簇，是由连续的线性氨基酸位点组成，不受蛋白空间结构的影响[17]。轮状病毒VP6蛋白的氨基酸序列在不同血清型或基因型间高度保守，其功能性区域位于105-328位点之间，其中122-147位点的氨基酸为主要聚合区域。2013年，Aiyebo等研究发现，VP6上存在高密度带电的残疾识别位点，这些位点是四聚体的抗原表位肽，当该位点的负电荷区域与轮状病毒单克隆抗体结合后，复制活跃的病毒颗粒通道Ⅰ，在空间上会造成封闭，从而转录产生的mRNA就不能从通道Ⅰ通过，进入宿主细胞，进而阻断自代病毒颗粒的形成。这种特殊的病毒中和反应机制与传统的免疫反应不同，这或许在机体发挥免疫的过程中占有重要地位，同时也为疫苗的研制提供了新的方向。

1. 2.2 VP6基因的分子特征及遗传进化分析 VP6基因序列是轮状病毒11个基因节段中最保守的，目前已成为多种检测方法的首选靶基因[18]。依据分类命名标准，VP6基因决定病毒的I型。GenBank中登录的BRV VP6全基因序列共有30个，未明确Ⅰ型的有15个，确定Ⅰ型的共15个分2种，分别为I2型13个、I5型2个。

系统进化分析表明，I5基因型的BRV单独的聚为一大支，I2基因型的BRV单独的聚为一大支。相同I2型BRV的VP6核苷酸序列的同源性在86.3%～98.1%；相同I5型BRV的VP6核苷酸序列的同源性为100%；I2型与I5型之间的同源性为77.8%～79.9%。I2型BRV的VP6氨基酸序列的同源性在97.2%～99.5%；I5型之间的同源性为100%；I2和I5型之间的同源性为90.4%～91.4%。由以上的分析可知，VP6作为最保守的靶基因，序列间也存在碱基变异，故我们应加强对VP6基因的实时检测，以便及时更新检测引物，提高检出率。

1. 3 VP7结构蛋白的功能及分子特征

1. 3.1 VP7结构蛋白的功能 轮状病毒VP7因毒株的不同，可由第7、8或9基因节段编码，全长297或326个氨基酸[19]。作为轮状病毒的主要中和抗原，VP7同VP4一样已被深入研究。Dormitzer等研究表明，VP7是一种钙离子结合蛋白，钙离子结合的必要位点是VP7氨基酸序列上第75和279位点的脯氨酸。Ca2+对轮状病毒VP7外壳蛋白的稳定性和成熟病毒颗粒的形成有至关重要的意义。Ningguo等研究发现，稀释Ca2+浓度将会导致具有3层颗粒结构的轮状病毒丢失外壳蛋白VP4和VP7，形成没有感染性的病毒的颗粒，而且只能通过脂质体的转染来感染易感细胞。在研究轮状病毒与细胞受体的相互作用时发现，在轮状病毒吸附细胞以后，VP7能够与整合素、和相互作用，体外、和单克隆抗体可以有效的阻止轮状病毒侵入宿主细胞，但是不能抑制轮状病毒与宿主细胞的结合。

1. 3.2 VP7基因的分子特征及遗传进化分析 VP7的氨基酸序列中有9个高变区域，这些高变区域在相同的血清型中相对保守，但在不同的血清型间却是高度变异的[20]。VP7的高变区涉及抗原位点的形成，根据其抗原性决定G血清型，目前已发现的G型达27种，其中G6、G8和G10型在牛轮状病毒中最常见[8],我国牛轮状病毒主要流行的G型是G6和G10型[6]。GenBank中登录的BRV VP7全基因序列共有209个，未明确G型的有44个，确定G型的共165个分9 种，分别为G1型1个、G3型14个、G5型9个、G6型81个、G8型17个、G10型39个、G15型2个、G21型1个、G24型1 个。

系统发育树显示，每种G基因型的毒株有单独的聚成不同的小支，G10基因型与G8基因型的BRV遗传进化关系较近，共同聚为一个支，这两种基因型有着相同的起源。核苷酸序列同源性比对显示， 相同G基因型VP7的核苷酸序列同源性在84.7%～99.1%之间，不同基因型之间同源性在66.9%～78.2%之间；VP7氨基酸序列同源性比对显示，相同G基因型VP7的氨基酸序列同源性在82.8%～95.9%之间，不同的G基因型同源性在68.0%～73.1%之间。由此可知，与VP4基因一样，不论核苷酸序列还是氨基酸序列，相同基因型之间高度保守，但不同G型之间VP7的序列却发生了很大的变异。

1.4 NSP4非结构蛋白的功能及分子特征

1. 4.1 NSP4非结构蛋白的功能 NSP4非结构蛋白是轮状病毒重要的毒力因子，是第一种被发现的肠毒素。在轮状病毒的复制和致病性中钙离子发挥着重要的作用，病毒颗粒的物理装配需要钙离子，而NSP4则可以选择性的使细胞外的钙离子进入细胞，提高细胞浆中钙离子的浓度[21]。细胞中钙离子浓度升高可导致氯离子的分泌，从而引发腹泻。所以进一步加深对NSP4的功能的研究，有助于寻找到轮状病毒新的治疗方案及研发有效的疫苗。

1. 4.2 NSP4基因的分子特征及遗传进化分析 NSP4是由第10或11个基因节段编码，基因全长为750 bp，只有一个开放阅读框架，编码175个氨基酸。Kirkwood等研究发现，NSP4可分为3个基因型，且每个基因型之间核苷酸同源性均大于90%。GenBank中登录的BRV NSP4全基因序列共有82个，未明确E型的有66个，确定E型的共16个分2 种，分别为E1型3个、E2型13个。系统发育树显示，这两种不同的基因型分别聚为不同的两大支。同源性分析比对发现，相同E型的NSP4基因序列同源性为86.7%～99.9%，不同E型的同源性为80.6%～82.9%，与之前报道的不同基因型间同源性高达90%以上有所不同。

2 小结与展望

随着科学技术的快速发展，针对BRV的研究也在不断深入。BRV作为公认的犊牛腹泻病毒之一，对牛养殖业的危害很大，因此制定出更好的预防措施尤为重要。现在最为常用的预防措施是疫苗注射，所以对BRV的分子特征及蛋白功能的了解有助于安全高效的疫苗的研发。就BRV而言，由VP6基因编码的VP6蛋白在不同血清型或基因型之间高度保守，是亚单位疫苗的首选，且有连续抗原表位，具有研制合成肽疫苗的潜力，但免疫原性仍然需要大量的验证，此外，即使VP6是最保守的基因，仍有碱基变异，本实验室前期研究发现VP6基因在牦牛上变异很大，影响了现有的PCR方法的检出[22]，所以对VP6基因的实时检测，及时更新检测引物，对提高检出率很重要； VP4和VP7外壳蛋白一直以来被认为具有免疫保护作用，是最主要的中和抗体，但是在不同型之间不具有交叉保护，作为疫苗的候选蛋白需要进一步的研究。此外，VP4基因和VP7基因是BRV分型的依据，现有的分型方法主要是套式PCR,最为经典的是Gouvea等建立的用来确定牛和猪轮状病毒G型和P型的RT-nested PCR方法，至今仍被很多研究者采用,但是仍有许多样本无法使用现有的方法分型，可见 VP4和VP7也有变异，未来的疫苗的研制也需加强监测力度；NSP4蛋白是BRV的重要毒力因子，在疫苗的研发中具有很大的潜力。

近年来有研究发现， BRV作为引起犊牛腹泻的重要病因之一，也可能导致人腹泻，在此基础上对于从人腹泻病料中分离到的RV进行全基因组分析后发现，BRV与人源RV之间有明显的重组现象[23]，因此重组后的RV可能对人和牛都具有感染力，其公共卫生学意义值得关注，但目前国内并没有对于BRV与人RV的关系和基因重组的研究，我们应加强对病毒的变异和重组的研究和监测， 为研究RV的更好的预防措施奠定基础。

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Progress on Molecular Biology Characteristics of Group A Bovine Rotaviruses

LI Fan ,ZHOU Fang ,YUE Hua,TANG Cheng
(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu，Sichuan,610041,China)

Bovine rotavirus (BRV) is one of the important pathogens of calf diarrhea.Therefore, it is very important to realize the molecular structure, function and genetic evolution of virus for control, prevention and detection method of BRV. The molecular characteristics and function of several important structural proteins and non-structural proteins of group A BRV were summarized in this review.

Bovine rotavirus；molecular characteristics；genetic evolution

2016-10-26

李 凡(1992-)，女(壮族)，云南文山人，研究生，主要从事动物病原分子生物学研究。 *通讯作者

S852.653

A

1007-5038(2017)06-0082-04