寄生虫蛋白质磷酸化修饰及磷酸化蛋白质组学研究进展

赵 彬，唐亚兰，陆 珂，曹晓丹，韩 倩，吕 超，王 涛，傅志强，林矫矫, 3，洪 炀*

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400;2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241;3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

文献综述

寄生虫蛋白质磷酸化修饰及磷酸化蛋白质组学研究进展

赵 彬1，唐亚兰2，陆 珂2，曹晓丹2，韩 倩2，吕 超2，王 涛2，傅志强2，林矫矫2, 3，洪 炀2*

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400;2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241;3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

蛋白质的磷酸化修饰是生命体内一种重要的且普遍存在的蛋白质翻译后修饰方式之一，蛋白质的磷酸化和去磷酸化是一种动态的生物调节过程，在生命过程中起着重要的作用。论文介绍了蛋白质磷酸化修饰的研究进展及其在寄生虫领域中的应用，并对其研究前景进行了展望。

磷酸化;寄生虫;磷酸化蛋白质组学

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内一种重要的并且普遍存在的蛋白质翻译后修饰。它是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白质特定位点上的过程，也是生物体内重要的共价修饰方式之一。真核生物细胞中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸[1]。其中，磷酸化的丝氨酸最多，苏氨酸次之，而酪氨酸最少，三者的比例约为1 800∶200∶1[2]。大多数磷酸化蛋白都有多个磷酸化位点，并且发生磷酸化的位点是可变的，因此，一种蛋白可能有多种磷酸化的形式。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，2%～5%基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸酶[3-4]。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰成为真核细胞中一种最普遍的调控方式。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化，这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡及肌肉收缩等过程在内的所有生命活动，因此被形象地描述为细胞生理活动的分子开关[5]。目前已知许多代谢过程异常与蛋白质的磷酸化修饰相关，鉴于其在生命活动中的重要作用，近年来，探索蛋白质磷酸化的奥秘及其对蛋白功能的影响已成为众多生物学家所关心的内容，在寄生虫学研究领域也已有一些关于磷酸化蛋白质功能研究的相关报道。

1 寄生虫蛋白质磷酸化修饰

真核起始因子2B(eIF2B)是参与真核翻译起始的重要蛋白，也是鸟苷酸交换因子。其在翻译起始过程中将eIF2上结合的GDP转换为GTP，使eIF2可以重新参与翻译起始，而eIF2α亚基的磷酸化修饰能够抑制真核起始因子2B的功能。Joyce B R等[6]发现刚地弓形虫磷酸化的eIF2α对于应激反应具有保守的调控作用，如果将该蛋白第71位的丝氨酸这一保守的氨基酸位点进行突变后，该位点便不会发生磷酸化修饰。结果发现突变虫株在生活史中的宿主细胞外阶段会受到影响，并且在体内试验中，突变虫株所引起的急性弓形虫病在发病时间上会发生明显地延迟，表明该位点的丝氨酸磷酸化修饰对虫体的生长发育具有重要作用。如果在速殖子的裂解周期中，特别是虫体在宿主细胞外的这个关键时期，将eIF2α及其所在的应激反应通路作为药物靶标，对于抵抗急性和慢性弓形虫病的发生可以产生多重治疗效果。Avila C C等[7]对布氏锥虫eIF2α的磷酸化修饰进行了相关研究显示，将196位可发生磷酸化修饰的苏氨酸突变为丙氨酸后，其磷酸化修饰受到影响，但是突变后的虫株仍然可以在小鼠和采采蝇中正常发育。因此，eIF2α亚基第169位的苏氨酸磷酸化位点对虫体的生长发育不是必须的。

Leykauf K等[8]发现恶性疟原虫的顶端膜抗原1(AMA1)是否被磷酸化在虫体的入侵过程中具有重要作用。研究显示该蛋白第610位丝氨酸的磷酸化受环单磷酸腺苷(cAMP)调节的蛋白激酶A(PKA)控制，如果将该位点的丝氨酸突变为丙氨酸而引起该位点无法进行磷酸化修饰，结果会严重影响虫体的入侵过程，提示PKA对疟原虫裂殖子的入侵过程具有重要作用。

Mandal G等[9]发现利什曼原虫LmjAQP1蛋白的活性受有丝分裂原活化蛋白激酶2(MAPK2)调节。这两种蛋白同时表达时与只有LmjAQP1单独表达时相比，虫体在低渗的条件下能较快的恢复形态。试验还发现LmjAQP1蛋白197位的苏氨酸是该蛋白的磷酸化位点，将该位点的氨基酸突变之后，虫体恢复形态的速度要明显变慢。LmjAQP1蛋白的磷酸化修饰能够使其代谢速度降低进而延长该蛋白活性的发挥。

Tang Q等[10]发现刚地弓形虫虫体外缘的肌球蛋白A是一类非传统的单体肌球蛋白，控制着虫体运动以及侵入和逸出宿主细胞。小分子化合物130038能够增强虫体的运动及入侵，使虫体内钙离子的水平增加，进一步引起钙依赖性的肌球蛋白A磷酸化修饰增强。如果将该蛋白中的主要磷酸化位点进行突变后，虫体在小分子化合物130038作用后的运动能力受到抑制，突变虫株即使在较高的钙离子水平下，逸出宿主细胞的速度会明显减慢。显示刚地弓形虫钙离子依赖的肌球蛋白A磷酸化修饰在虫体的运动以及侵入和逸出宿主细胞过程中发挥着重要作。Bonilla-Moreno R等[11]发现，溶组织内阿米巴原虫的肌球蛋白轻链(EhMLCI)能够结合重链形成有收缩性的肌动球蛋白，进而使阿米巴原虫具有运动活性。EhMLCI羧基端酪氨酸残基的磷酸化能够负调控肌球蛋白的活性。如果将该酪氨酸用苯丙氨酸进行替换，那么虫体的运动能力会受到影响，因此EhMLCI羧基端酪氨酸的磷酸化/去磷酸化能够直接影响肌球蛋白的功能。

在血吸虫中，蛋白的磷酸化修饰对虫体的生长、发育、繁殖等生命活动同样具有重要作用。Davies S J等[12]认为虫体表面存在有蛋白激酶，这些激酶的活性与信号传导的受体有重要联系。他们对曼氏血吸虫表膜蛋白中蛋白激酶的活性进行了分析，结果发现虽然在虫体被提取物中存在许多酪氨酸磷酸化的蛋白，但虫体表膜蛋白只具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的活性，而没有明显的酪氨酸激酶的活性。

酪氨酸蛋白激酶(TK)在信号传导通路中发挥着重要作用，它能引起许多生物进程的发生，如细胞的代谢、增殖、分化以及免疫调节等，在人类癌症治疗的研究中，也将其作为一种有潜力的药物靶点进行研究。早期研究发现，TK与血吸虫配对后虫体的分化有关，如雌虫卵黄腺和卵巢的发育。阻断该蛋白的作用可以减缓虫体的发育，降低虫体的产卵能力，进而缓解病理损伤[13-14]。因此该蛋白也被作为潜在的药物或疫苗靶标。曼氏血吸虫TK3和TK5都属于Src家族成员，它们都具有Src特异性激酶的活性而且在虫体繁殖过程中发挥重要作用[15-16]。TK3在雌雄虫的性腺中都有表达，通过药物对其抑制可以降低有丝分裂的活性以及雌虫的产卵能力[17]。TK4属于Syk激酶家族成员，它主要存在于睾丸和卵巢等生殖器官中。TK4所在的信号通路能够调节血吸虫性腺细胞的增殖和分化。TK6是一个新发现的Src家族激酶，它能与TK4相互作用并且是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活蛋白[13]。

Yan Y等[18]对曼氏血吸虫Ste-20样激酶进行了相关研究，发现该蛋白可以激活人胚胎肾细胞和爪蟾卵母细胞的Jun N末端激酶(JNK)通路和MAPK级联反应，它是生发中心激酶家族的新成员。免疫组化分析结果显示，该蛋白在成虫体中含量丰富，在宿主与寄生虫的相互作用中，其能够参与宿主MAPK级联反应的活化。

Walker A J等[19]将曼氏血吸虫的毛蚴分别暴露于对虫体具有抗性和适宜性的中间宿主光滑双脐螺的血淋巴中，然后对毛蚴中酪氨酸的磷酸化情况进行相关研究。结果发现暴露在适宜性的光滑双脐螺血淋巴中的毛蚴中，一个56 ku的酪氨酸磷酸化蛋白显著地增加了5倍，而暴露在抗性的光滑双脐螺血淋巴中的毛蚴中，该蛋白基本没有变化。使用酪氨酸激酶的抑制剂染料木黄酮处理毛蚴后发现，虫体的发育情况受到明显的影响，表明该酪氨酸磷酸化的抑制可以影响毛蚴的发育。共聚焦显微镜观察发现，该蛋白的磷酸化主要发生在体被。

Ludtmann M H等[20]发现曼氏血吸虫蛋白激酶C(PKC)在毛蚴向母胞蚴转变的前24 h内被磷酸化，在经过31 h和48 h的发育后，该蛋白的磷酸化分别降低了72%和86%。将PKC去磷酸化后，可以加速毛蚴向胞蚴阶段的转化。提示PKC的磷酸化能够抑制毛蚴向母胞蚴的转化。磷酸化的PKC主要分布在神经块、分泌囊泡、体被、纤毛板以及胚细胞中。

Long T等[21]对曼氏血吸虫的一种有丝分裂激酶-Polo样激酶(SmPlk1)的功能进行了相关研究，该蛋白在有丝分裂过程中具有保守功能，在爪蟾的卵母细胞模型中，其182位的苏氨酸被磷酸化后可以引起有丝分裂的发生。该基因在原胚细胞中的表达量较高，原位杂交的结果显示，该基因存在于雌虫的卵母和卵黄细胞中以及雄虫的精原细胞中。体外使用Plk的抑制剂BI2536作用于虫体后，虫体的性腺发生了改变，并且影响到卵细胞和精子的生成。

Swierczewski B E等[22]发现曼氏血吸虫cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基(SmPKA-C)对虫体的生存活力具有重要影响。试验发现该基因在尾蚴和雌性的成虫中高表达，在体外用PKA的抑制剂H-89或PKI 14-22酰胺酶对尾蚴进行处理后，可以导致尾蚴的活力降低，而对成虫进行处理后，能够抑制虫体的产卵能力并且该过程具有剂量依赖性。在小鼠模型中，曼氏血吸虫产卵量的减少也与虫体内该基因的表达下降以及PKA酶活力的降低有关，并且在该基因的表达恢复正常和PKA酶活力恢复正常后，虫体的产卵量也恢复正常。

Ressurreicao M等[23]对曼氏血吸虫p38 MAPK在毛蚴向母胞蚴转化过程中所起的作用进行了相关研究。他们发现在体外发育的前4 h，该蛋白的磷酸化水平比较低，当培养了19 h和28 h后，该蛋白的磷酸化水平显著增加了2.7倍和3.7倍。免疫组化显示该蛋白主要分布在虫体体被、神经块和胚细胞中。用抑制剂SB203580抑制该蛋白的活性后，能够显著增加毛蚴向母胞蚴转化的比例。反之，如果用茴香霉素增加该蛋白的活性，则会出现相反的结果。

2 寄生虫磷酸化蛋白质组学

由于生物体中磷酸化蛋白所涉及到的生物进程通常都是错综复杂的，例如细胞信号传导通路网络等，传统地针对单条信号传导通路以及单个磷酸化蛋白分子的研究策略存在一定的局限性，因此利用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质的磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中蛋白磷酸化修饰的状态及其变化，进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及分子机制，由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)的概念。其研究内容主要包括：①磷酸化蛋白质和肽段的检测；②磷酸化位点的鉴定；③磷酸化蛋白质的定量。通过该研究，可以揭示蛋白激酶和磷酸酶分别对蛋白磷酸化和去磷酸化的作用。

细胞内磷酸化蛋白的丰度较低，因此在规模化的识别和鉴定生物体内磷酸化蛋白质的表达及其变化之前，首先需要对磷酸化蛋白及其酶解肽段进行富集。目前常用的方法为固相金属亲和层析法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)、金属氧化亲和层析法(metal oxide affinity chromatography,MOAC)、强阳离子交换色谱(strong cation exchange chromatography,SCX)、免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)、氨基磷酸酯化学衍生法(phosphoramindate chemistry,PAC)等。近年来，在寄生虫研究领域，已经有不少学者利用上述的纯化方法对不同虫体的磷酸化蛋白质组进行了相关研究。

Nakayasu E S等[24]利用SCX的富集法对克氏锥虫的短膜期虫体进行了磷酸化蛋白组学的研究，一共鉴定到了237个磷酸化肽段，隶属于119种不同的虫体蛋白。其中明确匹配上的220个磷酸化位点中有148个是丝氨酸，57个是苏氨酸，8个是酪氨酸。免疫沉淀法和免疫印迹法确认了至少7个磷酸化的酪氨酸蛋白。这些鉴定到的磷酸化蛋白主要与细胞结构、运动性、物质转运、致病机制、DNA/RNA/蛋白代谢和信号通路等相关。

Hem S等[25]对杜氏利什曼原虫无鞭毛体的磷酸化蛋白组进行了分析，通过IMAC法对磷酸化蛋白进行富集和质谱分析，共鉴定到445个磷酸化蛋白，这些蛋白主要参与蛋白的代谢、应激反应和信号转导通路。又利用二氧化钛(MOAC法)对磷酸化肽段进行富集和质谱鉴定，在157个特异的磷酸化肽段中发现了181个特异的磷酸化位点，这些肽段来源于126个不同的蛋白中。在对锥虫以及高等真核生物的磷酸化位点的保守区进行多序列比对和聚类分析后发现，杜氏利什曼原虫特异的磷酸化蛋白残基与人的同系物具有较高的相似性，但是特异的磷酸化位点有明显的不同，这对设计新的抗寄生虫干预措施具有重要意义。

Treeck M等[26]通过IMAC法对恶性疟原虫的裂殖体和刚地弓形虫的速殖子的磷酸化蛋白组进行了相关研究，分别鉴定到5 000个和10 000个未知的磷酸化蛋白位点，提示蛋白的磷酸化修饰是这两种寄生虫中广泛存在的一种调节机制，并且发现该修饰在虫体的体内和体外蛋白中都存在，这可能与虫体的排泄分泌活动有关。两种虫体中都发现了磷酸化的酪蛋白，恶性疟原虫具有不一样的磷酸化基序，它主要是由基因组中的高A/T形成的。

Panichaku T等[27]利用IMAC方法对感染及未感染间日疟原虫的生长状态的红细胞磷酸化蛋白质组进行了比较分析，发现埃兹蛋白、辅肌动蛋白1和Rho激酶这3个磷酸化蛋白发生了显著得变化。其中生长红细胞的埃兹蛋白在与感染红细胞裂解无接触48 h～72 h后，磷酸化修饰减弱甚至消失。结果表明，间日疟原虫可通过下调埃兹蛋白的磷酸化水平来抑制红细胞的生长，进而导致疟疾引起的贫血症状。

Solyakov L等[28]结合磷酸化蛋白组和激酶组学的信息，通过反向遗传学的方法验证了恶性疟原虫无性繁殖期蛋白磷酸化的重要作用。他们将IMAC法和二氧化钛富集相结合，最终发现了存在于650个虫体蛋白上的1 177个磷酸化位点，这些蛋白主要参与DNA合成、转录、代谢、免疫逃避以及细胞吸附等生物进程。许多虫体蛋白激酶能在自身的调节残基上磷酸化，例如糖原合成激酶3和CDK-样激酶3。其中CDK-样激酶3第526位氨基酸的磷酸化对于该酶整体活性的发挥具有重要影响。该试验同时发现36个寄生虫蛋白激酶对于恶性疟原虫的无性繁殖阶段具有重要作用。

Lasonder E等[29]利用二氧化钛富集磷酸化蛋白的方法对恶性疟原虫胞外的裂殖子进行了磷酸化蛋白质组分析，试验共鉴定到1 765个磷酸化位点，其中有785个磷酸化位点在裂殖体中检测不到。生物信息学分析显示，这些差异的磷酸化蛋白主要与入侵过程有关。裂殖子磷酸化蛋白的相互作用网络分析显示，119个蛋白具有与细胞的运动及入侵相关的潜在作用，这些蛋白受到PKA、CDPK、PI3K及elF2激酶参与的翻译过程的调节。这些磷酸化蛋白的差异可能是由于恶性疟原虫在从胞内的裂殖体向胞外的裂殖子转变过程中，虫体不能通过降解血红蛋白来获得氨基酸而处于“饥饿”状态造成的。

Tsigankov P等[30]利用二氧化钛富集磷酸化蛋白的方法对杜氏利什曼原虫无鞭毛体和前鞭毛体的磷酸化蛋白质组进行了分析鉴定，共鉴定到627种发生磷酸化修饰蛋白中的1 614个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化模体“SF”在无鞭毛体中显著富集，鉴定到的一些酪氨酸磷酸化蛋白主要参与信号转导的通路中。在鉴定到的磷酸化蛋白中，超过半数的蛋白具有期别特异性或者在无鞭毛体和前鞭毛体中是呈现显著性差异的。

在日本血吸虫磷酸化蛋白质组的研究中，Luo R等[31]通过IMAC法对14 d童虫和35 d的日本血吸虫虫体蛋白中的磷酸化位点和磷酸化蛋白进行了相关研究，结果发现虫体中的92种蛋白含有127个不同的磷酸化位点。将14 d童虫和35 d的日本血吸虫虫体蛋白中的磷酸化肽段进行比较分析后，在两个阶段虫体中找到30种共有的磷酸化蛋白。这些蛋白包括一些信号分子和酶类，例如14-3-3蛋白、热休克蛋白90、肽基脯氨酰异构酶G、磷酸果糖激酶、胸苷酸激酶等。另外，试验还发现这些蛋白磷酸化位点的基序在生物进化上是比较保守的。

Cheng G等[32]通过二氧化钛富集磷酸化蛋白的方法对日本血吸虫14 d和35 d的雌雄虫体内的磷酸化蛋白质组进行了分析，一共鉴定到180个磷酸化肽段，代表了148个蛋白，进一步的分析显示，热休克蛋白90在这两个阶段的虫体和雌雄虫体中都能检测到，因此推测该蛋白能够直接或间接的与其他检测出的信号分子相互作用，并在调节虫体的发育过程中具有重要作用。同时，对一些检测到的性别特异性的磷酸化蛋白通过免疫组化或实时定量PCR进行了验证。

通过之前的磷酸化蛋白质组学研究发现，寄生虫体内同样存在大量参与其生命活动的磷酸化蛋白、肽段以及磷酸化位点，这些信息为我们深入研究蛋白的磷酸化修饰和寄生虫生长发育中的作用及调控机制提供了重要基础。

3 展望

蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程在生命活动过程中发挥着重要的作用，使蛋白质磷酸化的相关研究成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。大量试验表明，一些关键蛋白或者重要氨基酸位点的磷酸化修饰或去磷酸化，或者蛋白激酶/磷酸酶的活性受到抑制/过表达时，蛋白质的磷酸化过程会发生紊乱并严重影响寄生虫正常的生理状态，如寄生虫的入侵与逸出、自身信号通路的异常等。因此，对蛋白质的磷酸化修饰进行深入的研究对了解寄生虫磷酸化修饰蛋白在虫体寄生和生长发育过程中的作用具有重要意义，也可为筛选抗寄生虫病的候选疫苗分子和新药靶提供试验依据。

随着蛋白质组学研究技术的不断发展，磷酸化蛋白质组学已成为一门新的交叉学科和研究热点，它可以为我们提供大量可供深入分析研究的磷酸化、去磷酸化相关蛋白的数据。但前期研究在技术上还存在一定的局限性，例如蛋白质的磷酸化是一个不稳定的动态过程，磷酸化蛋白的丰度较低，其磷酸基团容易在分离过程中丢失等。因此，对磷酸化蛋白特异、高效的分离、富集技术及无损、高灵敏度的检测鉴定技术的开发会推动磷酸化蛋白质组学研究进一步发展。

近年来，随着生物质谱技术的迅速发展，磷酸化蛋白质组学研究已经进入定量磷酸化蛋白质组和比较磷酸化蛋白质组分析阶段。其不仅能检测磷酸化蛋白及其位点，还能对磷酸化蛋白的差异进行定量分析，进而可以找到可能是生物体处于不同状态的关键磷酸化蛋白分子或磷酸化位点，经定量分析后得到的差异磷酸化蛋白或磷酸化位点可能是造成生物体处于不同状态的重要分子，目前已经有学者开始采用该技术方法开展相关研究。

目前定量的磷酸化蛋白组分析策略可以依赖稳定同位素标记技术，在细胞培养过程中对氨基酸的稳定同位素进行标记(stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SILAC)。该技术将含有轻、重同位素型的氨基酸培养液分别对细胞进行培养，使细胞内的蛋白被同位素稳定标记，提取细胞蛋白并将其等量混合，酶切后结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术进行鉴定，通过分析不同同位素标记的磷酸化肽段的相对量而确定磷酸化蛋白的相对量。此外，美国ABI公司开发了一种多肽体外标记技术——同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。iTRAQ试剂由报告基团、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团组成，形成4种或8种相对分子质量均为145的等量异位标签，与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记。在串联质谱中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，带不同同位素标签的同一多肽产生质量不同的报告离子，根据报告离子的丰度进行不同样品间相同肽段的定量。

随着定量磷酸化蛋白质组的出现，许多科学家开始尝试利用上述方法来寻找影响生物体的关键磷酸化蛋白。

Kruger M等[33]利用SILAC的方法对胰岛素信号通路中所有酪氨酸磷酸化级联反应的变化情况进行了分析，发现了40个胰岛素诱导的效应因子及胰岛素信号通路中的7个新蛋白，揭示了胰岛素信号网络中蛋白质磷酸化等翻译后修饰和下游靶蛋白的改变与细胞生长、分化之间的关系3。Rinschen M M等[34]通过SILAC对肾集合管细胞中的磷酸化蛋白组的差异进行了比较分析，试验发现加压素能够降低JNK1/2和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化作用，而这两种蛋白的磷酸化又都可以进一步调控水通道蛋白-2第261位氨基酸的磷酸化，因此证明加压素是通过降低该位点的磷酸化作用而发挥作用的。Chen C等[35]通过SILAC法对不同细菌毒力因子诱导的巨噬细胞磷酸化蛋白质组的差异进行了相关研究。生物信息学分析的结果显示，两者的差异主要体现在与免疫相关的信号通路中，包括Erk1/2信号通路、，Jak/Stat信号通路、Jnk信号通路等。Batista M等[36]在研究中发现，布氏锥虫有丝分裂原活化蛋白激酶样激酶(MAPKLK1)对虫体的增殖具有重要作用，如果利用RNA干扰技术对该基因的转录水平进行敲除，虫体的生长会明显减慢。鉴于该蛋白可能在虫体蛋白的磷酸化过程中发挥着重要作用，作者利用二氧化钛富集磷酸化肽段的方法并结合SILAC对干扰前后虫体磷酸化蛋白质进行了分析，结果显示，一共鉴定到1 756个磷酸化位点，其中384个之前没有报道。虽然该蛋白对虫体具有重要作用，但是在磷酸化蛋白及位点上并没有发现太大差异。

迄今为止，寄生虫磷酸化蛋白组学上的研究大都还是从整体上分析虫体中磷酸化蛋白、肽段及其磷酸化位点，而通过比较磷酸化蛋白组的方法寻找影响虫体的关键磷酸化蛋白研究国内外报道较少，相信在不久的将来这一方法会在寄生虫学研究领域得到广泛应用。

[1] Kruse R,Hojlund K.Mitochondrial phosphoproteomics of mammalian tissues[J].Mitochondrion,2017,33:45-57.

[2] 刘秋林,钟月仙,万伟峰,等.植物磷酸化蛋白质组学研究进展[J].福建农林大学学报：自然科学版，2015，44(3)：225-231.

[3] Cohen P.The origins of protein phosphorylation[J].Nat Cell Biol，2002，4:E127-130.

[4] Frades I,Resjo S,Andreasson E.Comparison of phosphorylation patterns across eukaryotes by discriminative N-gram analysis[J].BMC Bioinformatics，2015，16:239.

[5] Rider M H.Role of AMP-activated protein kinase in metabolic depression in animals[J].J Comp Physiol B,2016,186:1-16.

[6] Joyce B R, Queener S F, Wek R C,et al.Phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2{alpha} promotes the extracellular survival of obligate intracellular parasiteToxoplasmagondii[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107:17200-17205.

[7] Avila C C,Peacock L,Machado F C,et al.Phosphorylation of eIF2alpha on Threonine 169 is not required forTrypanosomabruceicell cycle arrest during differentiation[J].Mol Biochem Parasitol,2016,205:16-21.

[8] Leykauf K,Treeck M,Gilson P R,et al.Protein kinase a dependent phosphorylation of apical membrane antigen 1 plays an important role in erythrocyte invasion by the malaria parasite[J].PLoS Pathog,2010,6:e1000941.

[9] Mandal G,Sharma M,Kruse M,et al.Modulation of Leishmania major aquaglyceroporin activity by a mitogen-activated protein kinase[J].Mol Microbiol,2012,85:1204-1218.

[10] Tang Q,Andenmatten N,Hortua Triana M A,et al.Calcium-dependent phosphorylation alters class XIVa myosin function in the protozoan parasiteToxoplasmagondii[J].Mol Biol Cell,2014,25:2579-2591.

[11] Bonilla-Moreno R,Perez-Yepez E A,Villegas-Sepulveda N,et al.Tyrosine phosphorylation/dephosphorylation of myosin II essential light chains ofEntamoebahistolyticatrophozoites regulates their motility[J].Mol Biochem Parasitol,2016,208:49-55.

[12] Davies S J,Pearce E J.Surface-associated serine-threonine kinase inSchistosomamansoni[J].Mol Biochem Parasitol,1995,70:33-44.

[13] Beckmann S,Buro C,Dissous C,et al.The Syk kinase SmTK4 of Schistosoma mansoni is involved in the regulation of spermatogenesis and oogenesis[J].PLoS Pathog,2010,6:e1000769.

[14] Beckmann S,Quack T,Burmeister C,et al.Schistosoma mansoni: signal transduction processes during the development of the reproductive organs[J].Parasitology,2010,137:497-520.

[15] Kapp K,Knobloch J,Schussler P,et al.TheSchistosomamansoniSrc kinase TK3 is expressed in the gonads and likely involved in cytoskeletal organization[J].Mol Biochem Parasitol,2004,138:171-182.

[16] Kapp K,Schussler P,Kunz W,et al.Identification,isolation and characterization of a Fyn-like tyrosine kinase fromSchistosomamansoni[J].Parasitology,2001,122:317-327.

[17] Quack T,Knobloch J,Beckmann S,et al.The formin-homology protein SmDia interacts with the Src kinase SmTK and the GTPase SmRho1 in the gonads of Schistosoma mansoni[J].PLoS One,2009,4:e6998.

[18] Yan Y,Tulasne D,Browaeys E,et al.Molecular cloning and characterisation of SmSLK,a novel Ste20-like kinase inSchistosomamansoni[J].Int J Parasitol ,2007,37:1539-1550.

[19] Walker A J,Rollinson D.Specific tyrosine phosphorylation induced inSchistosomamansonimiracidia by haemolymph from schistosome susceptible,but not resistant,Biomphalariaglabrata[J].Parasitology,2008,135:337-345.

[20] Ludtmann M H,Rollinson D,Emery A M,et al.Protein kinase C signalling during miracidium to mother sporocyst development in the helminth parasite,Schistosomamansoni[J].Int J Parasitol,2009,39:1223-1233.

[21] Long T,Cailliau K,Beckmann S,et al.SchistosomamansoniPolo-like kinase 1:A mitotic kinase with key functions in parasite reproduction[J].Int J Parasitol,2010,40:1075-1086.

[22] Swierczewski B E,Davies S J.Developmental regulation of protein kinase A expression and activity inSchistosomamansoni[J].Int J Parasitol,2010,40:929-935.

[23] Ressurreicao M,Rollinson D,Emery A M,et al.A role for p38 mitogen-activated protein kinase in early post-embryonic development ofSchistosomamansoni[J].Mol Biochem Parasitol,2011,180:51-55.

[24] Nakayasu E S,Gaynor M R,Sobreira T J,et al.Phosphoproteomic analysis of the human pathogenTrypanosomacruziat the epimastigote stage[J].Proteomics,2009,9:3489-3506.

[25] Hem S,Gherardini P F,Osorioy Fortea J,et al.Identification ofLeishmania-specific protein phosphorylation sites by LC-ESI-MS/MS and comparative genomics analyses[J].Proteomics,2010,10:3868-3883.

[26] Treeck M,Sanders J L,Elias J E,et al.The phosphoproteomes ofPlasmodiumfalciparumandToxoplasmagondiireveal unusual adaptations within and beyond the parasites' boundaries[J].Cell Host Microbe,2011,10:410-419.

[27] Panichakul T,Ponnikorn S,Roytrakul S,et al.Plasmodiumvivaxinhibits erythroid cell growth through altered phosphorylation of the cytoskeletal protein ezrin[J].Malar J,2015,14:138.

[28] Solyakov L,Halbert J,Alam M M,et al.Global kinomic and phospho-proteomic analyses of the human malaria parasitePlasmodiumfalciparum[J].Nat Commun,2011,2:565.

[29] Lasonder E,Green J L,Grainger M,et al.Extensive differential protein phosphorylation as intraerythrocyticPlasmodiumfalciparumschizonts develop into extracellular invasive merozoites[J].Proteomics,2015,15:2716-2729.

[30] Tsigankov P,Gherardini P F,Helmer-Citterich M,et al.Phosphoproteomic analysis of differentiatingLeishmaniaparasites reveals a unique stage-specific phosphorylation motif[J].J Proteome Res,2013,12:3405-3412.

[31] Luo R,Zhou C,Lin J,et al.Identification of in vivo protein phosphorylation sites in human pathogenSchistosomajaponicumby a phosphoproteomic approach[J].J Proteomics,2012,75:868-877.

[32] Cheng G,Luo R,Hu C,et al.TiO(2)-Based phosphoproteomic analysis of schistosomes:Characterization of phosphorylated proteins in the different stages and sex ofSchistosomajaponicum[J].J Proteome Res,2013,12:729-742.

[33] Kruger M,Kratchmarova I,Blagoev B,et al.Dissection of the insulin signaling pathway via quantitative phosphoproteomics[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105:2451-2456.

[34] Rinschen M M,Yu M J,Wang G,et al.Quantitative phosphoproteomic analysis reveals vasopressin V2-receptor-dependent signaling pathways in renal collecting duct cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107:3882-3887.

[35] Chen C,Wu D,Zhang L,et al.Comparative phosphoproteomics studies of macrophage response to bacterial virulence effectors[J].J Proteomics,2012,77:251-261.

[36] Batista M,Kugeratski F G,de Paula Lima C V,et al.The MAP kinase MAPKLK1 is essential toTrypanosomabruceiproliferation and regulates proteins involved in mRNA metabolism[J].J Proteomics,2017,154:118-127.

ProgressonProteinPhosphorylationandPhosphoproteomicsofParasites

ZHAO Bin1, TANG Ya-lan2, LU Ke2, CAO Xiao-dan2, HAN Qian2, LÜ Chao2, WANG Tao2, FU Zhi-qiang2, LIN Jiao-jiao2,3, HONG Yang2

(1.JiangsuVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Jurong,Jiangsu,212400,China;2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai,200241,China;3.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

Protein phosphorylation is one of the most important and widespread post-translational modifications in many cellular processes.Some key regulatory functions such as phospho-signalling cascades are regulated via protein phosphorylation/dephosphorylation in a complex and dynamic manner.The research progresses of protein phosphorylation and its applications in parasitology were reviewed,and the prospect of this study was also discussed in this paper.

phosphorylation;parasite;phosphoproteomics

2017-03-07

国家自然科学基金青年基金项目(31402192)

赵 彬(1982-)，男，黑龙江人，讲师，硕士，主要从事预防兽医学研究。*

S852.7;S852.33

A

1007-5038(2017)10-0092-06