外泌体在寄生原虫中的研究进展

李佳祺，杨 娜，尹德琦，李承桓，陈俊楠，赵 琳，王欣欣，孙琬琳，姜 宁

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)

外泌体在寄生原虫中的研究进展

李佳祺，杨 娜，尹德琦，李承桓，陈俊楠，赵 琳，王欣欣，孙琬琳，姜 宁*

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)

外泌体(exosomes)是由多种细胞分泌的囊状小体，内含大量的蛋白质、RNA和脂类等重要物质，在细胞间物质与信息的传递中起着重要作用。目前，对于外泌体的研究主要集中在肿瘤诊断和治疗等方面，而对于寄生虫领域外泌体的研究则刚刚起步。已有研究证明，寄生虫可利用外泌体作为细胞间通讯和与宿主联系的工具，通过多种机制产生外泌体，广泛传递其自身分子，调节宿主的免疫系统；还会利用外泌体相互转移传递毒力因子、药物抗性基因和分化因子，对疾病的发生发展具有重要作用。论文主要对外泌体在感染人类的多种寄生性原虫中的研究进展做一综述，为外泌体在寄生虫领域的研究提供新的思路。

外泌体；寄生虫；宿主；相互作用机制

1983年，Eberhard G T从体外培养的绵羊红细胞培养液上清中发现一种具有膜结构的小囊泡，将其命名为外泌体。起初外泌体并未引起人们的重视，一直被视为是细胞外排的“垃圾”。但最近数年，经研究发现外泌体所富含的“货物”有着重要的生物学意义。2013年的诺贝尔生理医学奖授予了美国科学家James E Rothman和Randy W Schekman以及德国科学家Thomas C Südhof，以表彰这三位科学家在细胞囊泡运输调控机制中所做出的杰出贡献。近几年，外泌体在哺乳动物和其他真核生物领域中的研究迅速扩散，但在寄生虫学领域的研究却刚刚起步。

最近的研究已经在动物模型、人宿主和昆虫载体中以及在体外和体内试验中观察到寄生虫产生外泌体；许多致病性原生动物寄生虫包括疟原虫、阴道毛滴虫、锥虫类和利什曼原虫类等，均可产生外泌体，并利用外泌体与宿主相互作用，在寄生虫之间转移传递毒力因子、药物抗性基因和分化因子，对寄生虫的发育进程，疾病进展以及宿主均产生重要的影响。

1 外泌体与胞外囊泡

外泌体(exosomes)是由细胞内的多泡体(MVB)与细胞膜融合释放到细胞外的囊泡状小体，直径约为30 nm～100 nm之间，具有典型的脂质双分子层膜结构。外泌体组成与其来源有关，但一般而言，外泌体都会含有以下几种物质： MHCⅠ类或Ⅱ类分子、热应激蛋白(Hsp)、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类[1]。外泌体可存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其他生物体液中；其中富含有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，在细胞-细胞间进行物质以及信息的传递中起到重要作用。 胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是指从细胞膜表面脱落或是由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径在40 nm～1 000 nm之间。根据来源不同，EVs主要可以分为两大类，即外泌体(exosomes)和核外颗粒体(ectosomes)。前者起源于多泡体(MVB)，后者则通过细胞膜出芽产生，两者都可被称作EVs[2]。

2 外泌体与阴道毛滴虫

阴道毛滴虫属后滴门，是一种泌尿生殖道寄生虫，寄生于男性和女性泌尿生殖道的上皮细胞，是人类最常见的非病毒性性传染病的病原[3]。Twu O等[4]通过荧光显微镜观察阴道细胞，发现阴道毛滴虫会产生大的MVB结构分泌EVs，分泌的EVs对阴道毛滴虫的黏附性和致病机制有重要作用。

2.1 黏附性

Szempruch A J等[5]发现源自阴道毛滴虫的EVs与哺乳动物的EVs共享物理特性，包括大小、密度和蛋白质组成。将具有低黏附性的阴道毛滴虫G3株与来自其他阴道毛滴虫分离株纯化的EVs短期共育，结果显示，G3株对外宫颈细胞的黏附性增强；添加从具有的优势黏附性寄生虫中纯化的EVs到男性前列腺上皮细胞或女性外宫颈细胞，结果表明，这种优势表型转移到了G3株寄生虫，这意味着阴道毛滴虫混合种群可能在男性和女性宿主中存活。

2.2 促炎细胞因子

阴道毛滴虫分泌的EVs通过与宿主外宫颈细胞膜融合进行相互作用，使装载的脂类和蛋白转移进入宿主细胞[5]。EVs在与外宫颈细胞相互作用时会导致促炎细胞因子IL-6和IL-8的分泌，但随后若用阴道毛滴虫感染却显示IL-8反应总体表现抑制，并未引起强烈的早期免疫应答。因此，EVs在宿主的免疫调节中具有一定作用，有助于阴道毛滴虫的存活。

3 外泌体与疟原虫

疟原虫属顶复门，寄生于宿主红细胞内，是引起人类疟原虫病的病原体。引起人类感染疟疾最常见的虫株为恶性疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫。大部分体外试验集中在生命周期中的红内期，观察到EVs在以上提到的所有种类疟原虫中都存在。

3.1 抗药性和性分化

疟原虫可以改变红细胞产生EVs的质量和组成，在EVs中掺入疟原虫的蛋白、脂质和核酸，包括抗药基因[6]。Regev-Rudzki N等[7]研究发现，恶性疟原虫通过EVs向敏感性寄生虫转移游离DNA来传递抗药性，并推测这种机制有助于疟原虫在人类感染期间转移耐药性。恶性疟原虫PfPTP2蛋白会使被感染红细胞的膜表面产生芽的结构，减少PfPTP2蛋白的表达量会使释放的EVs数量和恶性疟原虫转移耐药性的能力大幅度降低。此外，Mantel P Y等[8]发现虫体未破出红细胞前，在其性成熟和分化的期间，EVs的释放水平会显著的增加，通过体外试验进一步研究，用纯化的EVs刺激无性期的恶性疟原虫分化为配子即有感染蚊子能力的虫体，结果表明EVs在恶性疟原虫的分化中具有作用，改变EVs体内分泌的水平会直接影响恶性疟原虫感染蚊子的效率。

3.2 免疫激活

在被疟原虫感染的人和鼠中，可检测到其体内循环的红细胞和其他类型细胞的EVs总数明显增加，发现在感染期间人和动物患病的严重性也与EVs的增加量密切相关。Martin-Jaular L等[9]用从表现出很强的网织红细胞嗜性的约氏疟原虫株分离的EVs转染其他疟原虫株，可以增强其他虫株的网织红细胞嗜性，试验表明，EVs对疟原虫的细胞型嗜性是重要的。Marcilla A等[10-12]使用啮齿动物疟疾模型进行研究，结果显示EVs具有广泛的免疫调节效应，其经常导致促炎性反应。从感染伯氏疟原虫脑型疟疾的小鼠中分离的EVs培养巨噬细胞，会活化巨噬细胞使其增加肿瘤坏死因子(TNF)的分泌和TNF受体超家族蛋白CD40的表达。Mantel P Y等[8]通过体外试验进一步验证，从体外感染恶性疟原虫的红细胞中分离的EVs，刺激从人外周血分离的单核细胞，结果显示炎症反应标志物CD40、CD54和CD86出现上调和CD163下调，这些EVs还刺激并激活人巨噬细胞产生IL-10和促炎细胞因子IL-6、IL-12和IL-1β。这些试验证明在疟原虫在感染宿主期间产生的EVs可激活炎症反应，并广泛调节免疫细胞。

4 外泌体与克氏锥虫、布氏锥虫、利什曼原虫

锥虫与利什曼原虫为一类附有鞭毛的原虫，人类以及一些动物发生的严重疾病，如非洲昏睡病(布氏锥虫)、南美锥虫病(克氏锥虫)、利什曼病(利什曼原虫)等病，均由该类寄生虫引起[13]。所有这些动质体都以昆虫为载体传递到哺乳动物宿主，在宿主体内进行其生命周期中的一系列分化步骤。某种程度上讲，动质体的EVs是研究的最为透彻的寄生虫外泌体。

4.1 毒性和发展

Szempruch A J等[14]揭示出锥虫可通过鞭毛膜出芽以及延伸形成动态膜纳米管来形成EVs。这些EVs携带有特定的鞭毛膜蛋白，同时包含了一些与抗性作用相关的蛋白质，还有在宿主体内发挥毒力作用相关的蛋白质。研究发现，EVs能在寄生虫之间，也能在与宿主细胞之间传输毒力因子，这导致了非洲锥虫病的复杂性。此研究揭示出非洲锥虫病发病的重要机制，为如何治疗该疾病提供了一个新的思路。布氏锥虫虫株不感染人类，并且容易被人血清中灵长类特异性先天免疫分子[称为锥虫溶解因子(TLF)]杀死。但亚种罗得西亚锥虫已经通过表达血清抗性相关蛋白(SRA)发展了对TLF的抗性机制，它可以结合TLF使寄生虫能够在灵长类动物宿主中持续存在[15]。Truc P等[16]将两种虫株共培养并将从表达SRA蛋白的亚种虫株中提取的EVs直接添加给布氏锥虫，随后布氏锥虫表现出对TLF的抗性，这些数据可能解释人类混合锥虫感染的报告。布氏锥虫在血流中呈现密度依赖性分化，Mugnier M R等[17]证明EVs在此过程中具有作用。当在转运孔中生长时，通过交换在400 nm膜上扩散的培养基，布氏锥虫可以实现更大的培养密度[18]。这表明EVs通过膜的扩散时会降低EV的浓度，因此也降低它们对分化的任何刺激效应。

克氏锥虫通过MVB来源和在细胞膜表面出芽脱落分泌EVs。早期的克氏锥虫分泌蛋白组学工作表明被释放的含有EVs黏蛋白。近期，Garcia-Silva M R和Bayer-Santos E等[19-20]对克氏锥虫EVs的蛋白质组学分析显示其中富含免疫原性蛋白质，并且进一步分级检测到tRNA衍生的小RNA(tsRNA)的存在，这种小RNA与其他生物体中的小干扰RNA(siRNA)具有相似的功能。类似地，从相关的动质体杜氏利什曼原虫和巴西利亚利什曼原虫的纯化的EVs也显示tsRNA的富集，虽然他们在利什曼原虫属中的作用尚不明确[21]。SRNAs通过EVs的转移改变寄生虫群体在感染和应激反应情况。

4.2 病理学、免疫调节和宿主代谢

布氏锥虫的分泌到组织中EVs的差异可以直接影响疾病进展和免疫应答。Szempruch A J等[14]试验表明，血液中布氏锥虫纳米管衍生的EVs与宿主红细胞膜融合，融合由EVs表面上的未确定的蛋白质介导，融合导致脂类和寄生虫特异性抗原(包括免疫原性变体表面糖蛋白(VSG))转移到红细胞表面，这种相互作用也改变红细胞膜的物理性质，并且可以引起肝和脾中的巨噬细胞清除受感染的红细胞。非灵长类哺乳动物感染克氏锥虫会引起贫血，并常常导致宿主死亡[22]。当用纯化的布氏锥虫的EVs体处理红细胞，将处理好的红细胞注射到小鼠中时，它们被快速清除，并且EVs的注射导致两种不同的小鼠品系的贫血，分析原因，在感染布氏锥虫期间观察到的严重贫血可能是由于EVs对红细胞生化特性的重塑造成的。

克氏锥虫分泌的EVs蛋白质组学分析显示其富含宿主与寄生虫相互作用、免疫调节和细胞信号相关的蛋白质[23]。Nogueira P等[24]证明来自克氏锥虫的EVs具有一些寄生虫菌株特异性，会导致脾细胞产生IL-10和促炎细胞因子TNF，干扰素-γ(IFNγ)和IL-6。Martins N O等[25]发现在体外产生的克氏锥虫EVs包含TcSMP(一类称为克氏锥虫表面膜蛋白的抗原)，纯化的TcSMP通过改变宿主细胞中的钙信号，抑制寄生虫侵入宿主细胞，并且EVs可以局部分散TcSMP以限制与高寄生物负荷的位点紧邻的细胞的寄生虫侵入，从而也限制组织破坏和免疫细胞的募集。这些研究结果表明克氏锥虫EVs会调节器官嗜性，并提供一些特定的保护位点。

杜氏利什曼原虫，墨西哥利什曼原虫和利什曼原虫可分泌EVs的关键证据取自对分泌蛋白质的分析。蛋白质组学分析显示EVs中富含先前已经在来自其他真核生物中确定的蛋白质：甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、亲环蛋白A和表面金属蛋白酶GP63(也称为利什曼原菌素)，这些已知的寄生虫毒力因子[26-27]。杜氏利什曼原虫的EVs包含几种免疫调节蛋白，例如众所周知的T细胞抗原和在侵入宿主细胞时期所需的毒力因子。分析在沙蝇载体内的婴儿利什曼原虫和硕大利什曼原虫显示，EVs与寄生虫接种物一起产生并转移到宿主体内，在宿主体内刺激炎症反应。杜氏利什曼原虫可以侵入小鼠肝细胞，改变肝脏中的脂类代谢，降低血清胆固醇水平[28]。这些研究结果表明，利什曼原虫的EVs在哺乳动物宿主中具有广泛的靶向目标和免疫抑制作用。

5 外泌体与寄生虫病治疗

如上所述，寄生虫EV具有两个广泛的效应：免疫调节即经常引起促炎反应，以及通过与组织和特定类型细胞的相互作用调节疾病发展。阻断EVs与靶宿主细胞的相互作用可以防止免疫活化和发病。例如，通过其减少在疟原虫和利什曼原虫感染免疫抑制和减少寄生虫负担和疾病严重性。在布氏锥虫引起的昏睡病的情况下，对于存活来说，抗寄生虫贫血的能力要比对寄生虫血症的控制更重要，由于布氏锥虫来源的EVs会通过暴露在EVs表面的蛋白质与靶膜相互作用，那么未来可以努力鉴定这些促融合素以提供用于有力预防疾病的工具，包括贫血和可能的布氏锥虫迁移到特定的宿主组织的研究[22]。EVs可应用于活性感染期间的诊断以及治疗应用，除此之外，还可成为用于提供疫苗接种的新工具。上述在动物模型试验中用疟原虫属的EVs免疫，显示出有效的结果[9]。在硕大利什曼原虫和原生动物寄生虫弓形虫的小鼠研究中，使用经寄生虫抗原或寄生虫细胞预处理的宿主细胞产生的EVs会引起宿主的保护性免疫应答[29]。使用寄生虫和宿主产生的EVs是寄生虫病治疗的新选择。

6 展望

病原性寄生虫在全球范围内广泛的引起人类和动物疾病，给许多国家的发展带来巨大的社会经济负担。与其他生物体中外泌体的研究相比，我们在寄生虫领域中外泌体的研究最近才开始被揭开。但外泌体的出现给寄生虫科学研究带来了新的思路和模式。近期，寄生虫特异性EVs的数据也开始被并入EuPathDB中，这充分表明寄生虫与其他真核生物类似，使用EVs进行重要的信息交流。虽然，EVs在有些寄生虫中的机制和作用还未被完全解密，但随着研究的不断深入，外泌体可能成为未来治疗某些寄生虫病的新选择，带来更为有效和积极的治疗结果，推动寄生虫领域的进步和寄生虫治疗的发展。

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AdvancesinExosomesofProtozoanParasites

LI Jia-qi，YANG Na，YIN De-qi，LI Cheng-huan，CHEN Jun-nan，ZHAO-Lin，WANG Xin-xin，SUN Wan-lin，JIANG Ning

(ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang，Liaoning,110866,China)

Exosomes secreted by various types of living cells are small vesicular bodies that contain many types of proteins,RNA and lipids and may be involved in cell-to-cell substance transporting and signaling.At present,the study of exosomes mainly focused on tumor diagnosis and treatment,and the exosomes research in parasite field has just started.Studies have shown that parasitic unicellular eukaryotes use exosomes as vehicles for intercellular communication and host manipulation.By using various mechanisms to generate exosomes and by transferring a wide range of molecules through exosomes,pathogenic protozoan are able to modulate the immune system of the hosts.In addition,exosomes are able to transfer virulence factors,drug-resistance genes and differentiation factors between parasites,which play an important role in the development of the disease.In this review,we explores recent insights into the biology of exosomes from human infectious protozoan parasites,and provided new ideas and models for the study of exosomes in the field of parasites.

exosomes; parasite; host; interaction mechanism

S852.72

A

1007-5038(2017)10-0102-05

2017-03-29

沈阳农业大学人才引进项目(8804/880415001)

李佳祺(1994-)，女，辽宁朝阳人，硕士研究生，主要从事于寄生虫学研究。*