甘薯中β‐淀粉酶水溶剂法提取的研究

梁锦荣

(云浮市环境监测站 527300)

甘薯中β‐淀粉酶水溶剂法提取的研究

梁锦荣

(云浮市环境监测站 527300)

本文从β-淀粉酶的来源、性质、提取方法、纯化、鉴定、应用和保存等几个方面综述了它们的研究进展。目的是，确定水溶剂法从甘薯中提取β—淀粉酶的最佳条件，为工业应用提供科学依据。从时间、温度、pH、还原剂以及表面活性剂等单因素探讨了甘薯中β-淀粉酶的提取条件。并通过正交实验对提取工艺进行了优化。最佳提取条件为提取时间1h、提取温度40℃、酸度pH 6.5。0.1mol L-1Na2S2O5，0.5（w/v）% NaHSO3，0.（w/v）% Triton-100使提取量提高10～20%。

甘薯；β-淀粉酶；提取方法；酶活力.

1 预备实验

1.1 仪器

pHS-3C数字酸度计，7200分光光度计，HH-2数显恒温水浴锅，刻度移液管，试管，烧杯，玻璃棒，DHG-9060A型电热恒温鼓风干燥箱，全自动电光天平，直流稳压电源，刻度吸量管，真空干燥器，容量瓶，秒表，SHZ-D（III）循环水式真空泵。

1.2 β-淀粉酶的酶活力测定

1.2.1 麦芽糖标准曲线的绘制

准确称取于105～110℃干燥后的麦芽糖100毫克，用蒸馏水溶解，定容至50毫升容量瓶中，配成2毫克／毫升标准溶液。按表1比例操作后，将各试管在沸水浴l5分钟，迅速冷却至室温。加入10.5 mL蒸馏水稀释，摇匀，在550 nm处比色测定。以OD值为纵坐标，麦芽糖浓度为横坐标，作麦芽糖标准曲线。其线性回归方程为y = 1.0545 x-0.0773；r2 = 0.999。该曲线用于计算β-淀粉酶水解淀粉的实验中所释放出的还原糖量。

1.2.2 β-淀粉酶活力测定

DNS，配制后经放置二十天后使用。具体操作如下：取适当稀释倍数的酶液0.1 mL于9.9 mL 2%（w/v）的可溶性淀粉溶液中（pH 6.0，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液），淀粉和酶的溶液在40℃时预热3 ～5 min后再混合。反应15 min 后，移取0.1 mL混合液到1.5 mL DNS和0.4 mL蒸馏水中，立即放入沸水浴中加热15 min，随后迅速冷至室温，再用10.5 mL二次蒸馏水稀释。用分光光度计于550 nm处测定。

酶活力定义：在40℃、pH 6.5的条件下，每分钟水解1 mg麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（1 U）。

2 实验部分

2.1 粉酶提取

材料取一定量新鲜的甘薯，洗净去皮，切细，加入2倍（w/v）的去离子水，至于豆浆机中进行打浆粉碎7min。然后倒入干净烧杯，用去离子水洗涤豆浆机壁，一共用去离子水为甘薯的6倍（w/v）。将料液分装，然后在不同的酸度、温度、盐、表面活性剂、还原剂或螯合剂下提取一段时间。收集用双层纱布过滤的滤液后，在4000 r / min的离心机上离心15 min。倾出清液，取0.1 mL上清液，按β-淀粉酶活力测定方法测定酶活力。

2.2 实验结果与讨论

3.3.1 提取时间

甘薯β淀粉酶提取量随时间变化较为敏感，在提取时间 1 h处有最大酶活力 。提取时间低于1 h，提液酶活力上升较迅速，1 时后酶活力逐渐下降 。由此可见，提取最佳时间为 1 h，提取时间过短，β淀粉酶来不及溶出，提取时间过长，易感染杂菌，β淀粉酶也易变质。因此，提取时间选为0.5 h为宜。

3.3.2 提取温度

温度对酶的提取有显著的影响。一般来讲，适当地提高温度，可提高酶分子在水溶液中的扩散速度，也可以增大酶的溶解度，但温度过高，则容易引起酶的变性失活。

保持料水比、提取酸度和提取时间不变，甘薯中β-淀粉酶的最佳提取温度为40℃。当提取温度超过40℃时，β-淀粉酶会因为提取温度过高而部分失活，从而导致提取率下降。

3.3.3 最适pH

去洗净去皮的甘薯适量，经豆浆机打浆7min，提取温度40℃，液料比1:6的条件下，分别于 pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的提取液中提取1h，考察不同酸度对甘薯中β淀粉酶提取的影响。

酸度对酶提取的影响较大。在pH 6.5时酶的提取酶效果最佳。pH低于5或者pH大于7时，酶的提取量急剧下降，说明过酸或过碱都可能引起蛋白质可解离基团的变化，从而使蛋白质变性失活。

3.3.5 还原剂

β-淀粉酶的催化活性基团为半胱氨酸（Cys），含有巯基，该基团易被金属离子或氧化剂所屏蔽。所以，向浆液中添加一定量的还原剂或螯合剂能排除重金属离子和氧化剂的干扰，进而提高β-淀粉酶的提取率。

研究表明，无水Na2SO3 能提高约14%的产量，NaHSO3能使酶的提取率提高10%，Na2S2O5能使酶的提取率18%。而L-胱氨酸对提取贡献不大。

3.3.6 表面活性剂

一定量的表面活性剂可以与细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜的结构破坏，从而增加细胞膜的通透性。根据实验结果可知Triton-100对酶提取量有较明显的促进效果，而Tween 80对提取效果影响不大。

3.3.7 正交实验

3.3.7.1 正交试验方案及结果

根据实验，选出影响提取的几个条件：提取温度、提取酸度、提取时间，按照正交试验表设计正交试验。按照表 5操作后进行提取并测量酶活，根据正交试验找出最佳提取条件。

由结果可知：（1）影响提取的最主要因素为时间，其后是提取酸度，影响最小的是提取温度。（2）最佳提取条件是：提取时间1 h，提取温度为40℃，提取酸度pH 6.5。

4 结论

本文主要讨论了提取时间、温度、pH、还原剂、表面活性剂等因素对甘薯中酶的提取率的影响，并通过正交实验确定了最佳提取方案。研究表明，时间对提取率的影响最为明显，同时，加入一定量的还原剂和表面活性剂对于提高甘薯中β-淀粉酶的提取量可以起到一定的帮助。实验表明，无水Na2SO3 能提高约14%的产量，NaHSO3能使酶的提取率提高10%，Na2S2O5能使酶的提取率18%，Triton-100对酶提取量有较明显的促进效果，而Tween 80对提取效果影响不大。

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B

1007-6344（2017）02-0304-01

据研究表明，水溶剂法从甘薯中提取β淀粉酶可以应用到工业生产。