Toll样受体4在脓毒症大鼠心肌中的表达

郑晓丽，陈芳，张小乔，刘伯毅

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院综合医疗科，湖北 十堰 442000)

Toll样受体4在脓毒症大鼠心肌中的表达

郑晓丽，陈芳，张小乔，刘伯毅

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院综合医疗科，湖北 十堰 442000)

目的 观察Toll样受体4(TLR4)在脓毒症大鼠心肌组织中的表达，探讨其在脓毒症心肌损伤发生机制中的作用。方法将40只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(SH组，n=20)及脓毒症组(CLP组，n=20)，采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症动物模型，24 h后，检测各组的血清脑钠肽(BNP)、肌钙蛋白I(cTnI)的水平，观察心肌组织病理变化及心肌组织肿瘤坏死因子(TNF-α)和TLR4的表达水平。结果CLP组大鼠出现明显的心肌损伤(心肌水肿及炎性细胞浸润，心肌细胞结构松散、紊乱)，CLP组大鼠血清BNP和cTnI水平分别为(5.33±0.26)ng/mL、(3.89±0.13)ng/mL，均高于SH组的(1.05±0.19)ng/mL和(0.87±0.07)ng/mL，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；CLP组大鼠心肌组织的TNF-α和TLR4表达水平分别为(23.71±1.59)ng/mL、(38.03±5.02)，均高于SH组的(8.99±0.52)ng/mL和(11.32±2.51)，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。结论TLR4在脓毒症大鼠心肌组织中表达上调，TLR4可能在脓毒症心肌损伤发病机制中起重要作用。

Wistar大鼠；脓毒症；心肌损伤；Toll样受体4

脓毒症是临床上非常难处理的棘手问题，多器官功能障碍是脓毒症高死亡率的主要原因，心肌损伤是脓毒症严重并发症之一，发生率可达40%～50%，直接影响脓毒症患者预后[1]。脓毒症心肌损伤发生机制复杂，部分原因及机制仍不明，进一步探明其发生机制对脓毒症诊断、预防及治疗上具有重要的意义。Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)是Toll样受体(toll like receptors，TLRs)家族中的一种，在脓毒症及心血管疾病方面已有部分研究[2-3]，本研究旨在通过动物实验，探讨TLR4在脓毒症心肌损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组 本实验在湖北医药学院动物实验中心完成，实验动物及试剂均由该中心提供。健康雄性Wistar大鼠40只，体质量220～300 g，随机分为假手术组(SH组，n=20)及脓毒症组(CLP组，n=20)。

1.2 模型制作 采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症动物模型，大鼠禁食12 h，禁水2 h，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定于动物手术台上，消毒、铺巾，在腹部正中作切口，暴露并游离出盲肠，CLP组：在距盲肠末端用4#丝线结扎，并用18#针头于盲肠游离末端穿孔，将盲肠放回腹腔原位，关腹。SH组：不结扎、不穿孔盲肠，将盲肠放回腹腔原位，关腹。术后进食自由，24 h后抽取股静脉血2 mL，处死大鼠。

1.3 检测方法

1.3.1 血清血清脑钠肽(BNP)、肌钙蛋白I(cTnI)测定 将静脉血分离血清，采用ELISA方法，按试剂盒说明测定BNP、cTnI。

1.3.2 病理学检查 切取左心室两块心肌组织，取一块心肌组织用2.5%戊二醛溶液固定12 h，HE及Masson染色，制备心肌组织切片，在显微镜下观察心肌组织病理学变化。

1.3.3 心肌组织TNF-α及TLR4测定 另一块心肌组织加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS)，用-70℃液氮冷冻保存备用。标本融化后将匀浆保持在2℃～8℃的温度，3 000 r/min离心20 min。收集上清液待检。采用ELISA法测定TNF-α、双抗体夹心ELISA法测定心肌组织TLR4蛋白表达，按照试剂盒操作步骤操作，在400倍光镜下对每张组织切片随机选取5个视野进行观察，采用MIAS-2000医学图像分析系统进行TLR4蛋白半定量分析。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠血清BNP和cTnI水平比较 CLP组大鼠血清BNP、cTnI水平显著升高，与SH组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 两组大鼠血清BNP和cTnI水平比较（ng/mL，±s）

表1 两组大鼠血清BNP和cTnI水平比较（ng/mL，±s）

组别SH组CLP组t值P值例数20 20 BNP 1.05±0.19 5.33±0.26 6.256＜0.01 cTnI 0.87±0.07 3.89±0.13 4.398＜0.01

2.2 两组大鼠病理学检查结果比较 HE染色：SH组心肌未见明显异常(图1)，CLP组可见心肌水肿及炎性细胞浸润，心肌细胞结构松散、紊乱(图2)。masson染色：SH组心肌未见明显异常(图3)，CLP组可见心肌细胞肥大、水肿及坏死，心肌细胞排列紊乱(图4)。

图1 SH组HS染色病理学改变(×400)；图2 CLP组HS染色病理学改变(×400)；图3 SH组masson染色病理学改变(×400);图4 CLP组masson染色病理学改变(×400)

2.3 两组大鼠心肌组织TNF-α及TLR4表达比较 免疫荧光染色后(棕黄色胞浆为阳性细胞)，心肌组织TNF-α表达阳性细胞数量：SH组数量较少(图5)，而CLP组数量显著增多(图6)。心肌组织TLR4表达阳性细胞数量：SH组数量较少(图7)，而CLP组数量显著增多(图8)。蛋白定量分析结果显示，心肌组织CLP组大鼠的TNF-α及TLR4表述水平较SH组显著，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表2。

图5 SH组心肌组织TNF-α表达(×400)；图6 CLP组心肌组织TNF-α表达(×400)；图7 SH组心肌组织TLR4表达(×400)；图8 CLP组心肌组织TLR4表达(×400)

表2 两组大鼠心肌组织TNF-α及TLR4表达水平比较(±s)

表2 两组大鼠心肌组织TNF-α及TLR4表达水平比较(±s)

组别SH组CLP组t值P值例数20 20 TNF-α(ng/mL) 8.99±0.52 23.71±1.59 7.521＜0.01 TLR4 11.32±2.51 38.03±5.02 8.138＜0.01

3 讨 论

脓毒症是宿主对感染的特异性反应导致的威胁生命的器官功能障碍[4]，心肌损伤即是其表现之一，发生率很高，进展迅速，直接影响脓毒症患者临床预后。脓毒症心肌损伤的主要表现为：心脏收缩和舒张功能损害，以心脏扩大、左室射血分数下降为主要特征[5]。BNP和CTnI是临床常用的评估心功能不全及心肌损伤的标志物，在脓毒症患者中，其水平明显升高，被证实是可评估脓毒症患者心肌损伤的标志[6]。脓毒症心肌损伤在光镜下表现为心肌纤维断裂现、肌膜细胞增生、心肌细胞空泡变性等[7]。

本研究通过CLP法制作脓毒症模型，结果显示大鼠CLP组大鼠血清BNP、cTnI水平显著升高(P＜0.01)，病理学检查HE染色及Masson染色均提示心肌损伤表现。同时，心肌组织TNF-α表达也明显升高(P＜0.01)，提示心肌局部炎症反应的存在。而SH组相应指标正常，结果表明脓毒症心肌损伤模型制作成功。

引起心肌损伤的机制复杂，且尚未完全明确，目前认为可能的机制包括[8-9]：(1)细菌毒素、细胞因子作用；(2)线粒体功能障碍；(3)心肌细胞内Ca2+超载；(4)心肌细胞凋亡；(5)肾素-血管紧张素系统激活等。本研究发现：CLP组大鼠心肌组织TLR4表达显著高于SH组(P＜0.01)。提示心肌TLR4表达升高在脓毒症心肌损伤发病机制中可能起重要作用。

TLR4在人体内分布广泛，主要表达在参与宿主防御功能的细胞上，主要分布在外周血白细胞和淋巴组织的中，在心肌细胞和微血管内皮细胞中也有分布[10]，TLR4在心血管方面的作用包括：动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭等[3]。

在脓毒症心肌损伤方面，TLR4的主要作用机制可能是：(1)TLR4介导的信号通路激活NF-κB，导致TNF-α、IL-1炎症介质增加，发生SIRS，最终导致脓毒症及MODS[11]。TNF-α等炎症介质可通过直接损伤心肌纤维、降低β-肾上腺素能受体敏感性、降低钙离子敏感度、促使氧自由基生成及诱导心肌细胞凋亡参与心室重塑等作用而导致心肌损伤[12-13]；(2)TLR4能通过作用于凋亡相关基因Bcl-2/Bax、p53、Fas/FasL等促进心肌细胞凋亡，加重心肌的损伤[14]。

本研究表明，脓毒症大鼠心肌TLR4表达升高，在脓毒症心肌损伤中可能起重要作用，通过调控TLR4表达，对于防止脓毒症心肌损伤发生可能有重要临床指导价值。

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Effect of TLR4 in myocardial tissue of septic rats.

ZHENG Xiao-li,CHEN Fang,ZHANG Xiao-qiao,LIU Bo-yi. Department of Geriatric Medicine＆General Medicine,Shiyan Taihe Hospital/the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptor 4(TLR4)in myocardial tissue of septic rats,and it’s roles on sepsis-induced myocardial injury in rats.MethodsForty healthy male Wistar rats were randomly divided into sham group(SH group,n=20)and sepsis group(CLP group,n=20).The sepsis models were established by cecal ligation and puncture(CLP).The levels of serum brain natriuretic peptide(BNP)and cardiac troponin I (cTnI)were detected after 24 hours.The myocardial tissue pathological changes and the expression levels of tumor necrosis factorα(TNF-α),TLR4 in myocardial tissue were observed.ResultsIn CLP group,myocardial tissue was seriously injured(myocardial edema and inflammatory cell infiltration,loose and disorganized myocardial cell structure). The levels of serum BNP,cTnI in CLP group were increased than those in SH group,with BNP(5.33±0.26)ng/mLvs(1.05±0.19)ng/mL and cTnI(3.89±0.13)ng/mLvs(0.87±0.07)ng/ml,allP＜0.01.The levels of myocardial TNF-α, TLR4 in CLP group were increased than those in SH group,with TNF-α(23.71±1.59)ng/mLvs(8.99±0.52)ng/mL and TLR4(38.03±5.02)vs(11.32±2.51),allP＜0.01.ConclusionThe expression of TLR4 increased in myocardial tissue of septic rats,and TLR4 may play an important role in the pathogenesis of sepsis-induced myocardial injury.

Wistar rats;Sepsis;Myocardial injury;Toll-like receptor 4(TLR4)

R-332

A

1003—6350（2017）06—0872—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.003

2016-10-11)

刘伯毅。E-mail：liuboyi66@163.com