开放式组织培养研究进展与前景

王凯+张昊

从培养条件、培养成本、培养环境、抑菌剂及现阶段存在的问题几个方面综述了植物开放式组织培养研究的进展，并展望了未来发展的前景。

【关键词】污染；开放式组织培养；抑菌剂

1839年，德国生理学家Theodor Schwann（西奥多·施旺）首次提出“细胞学”的概念，指出细胞有机体在适宜的外部条件下都具有独立发育的潜能，在其之后，Haberlandt进一步提出了“细胞培养”的概念，提出了植物细胞全能性理论。自此，开放式组织培养研究迎来高潮，高效植物繁殖技术空前发展并带来了巨大的经济价值，被广泛的应用于科研与生产各项领域之中。但由于植物组织培养技术对于无菌环境的要求极为严格，仅就目前的科研水平来说，常态化的保持无菌环境成本巨大，加之植物的种类、取材的时间、处理的方法、消毒的方式以及工作台的质量等都有可能产生污染，因此污染问题的控制成为限制植物组织培养技术发展以及推广与普及的瓶颈，迫切需要进行研究和提升。本文即从培养条件、培养成本、培养环境、抑菌剂及现阶段存在的问题出发，阐述植物开放式组织培养的应用现状及发展前景，并提出相关间接和建议，希望能为组织培养技术的发展提供理论借鉴和参考，略尽绵薄之力。

1 培养条件

在烟草组织培养试验中，利用自然温度和太阳辐射光代替日光灯进行固体培养，取得了很好的效果，同时在组培室的设计中如何建立理想的利用自然光源的组培室也是至关重要的，培养器容器也有简化的相关报道，极大降低了成本。在非洲菊组培快繁中让自然温度和太阳辐射光来代替日光灯和空调等设备，如此就可减少用电量，降低成本，且不影响试管苗的质量。

2 减少成本的研究

为进一步降低植物组织培养成本，我们分别以自来水、蒸馏水、雨水为材料进行试验配制培养基。通过相关数据分析，利用自来水与蒸馏水所配制出来的培养基上的植物生长情况数据相近，发育正常；而用三者进行马铃薯的培养试验时，发现雨水所制作出的培养基较自来水以及蒸馏水更有利于植株发展，雨水所制作的培养基马铃薯根多而长、植株深绿、发育优良，更有利于移栽（有些工业地区的雨水呈酸性，因此，这些地区的雨水会对植物的生长产生不利影响，不能用来配制培养基）。

除了选取材料以控制植物组织培养成本之外，培养容器的选择也是减少成本的又一重要方式。该项实验中，我们分别以罐头瓶、简易塑料瓶、传统三角瓶等材料对象进行试验，研究发现：使用冰盒及塑料盒对樱桃和苹果进行瓶外生根试验时，同使用三角瓶时作物发育情况基本相同且生长状态更为良好（但是塑料盒容积较大时，植株褐化严重、少数愈伤组织变褐，导致植株被污染或坏死）。此外，一次性塑料杯在实验室虽然同罐头瓶、简易塑料瓶等材料数据相同，但使用及密封过于繁琐和耗材，因而不适用于在组织培养中应用。

相关研究发现，含糖浓度以及有机物较低的生长环境不适宜菌类的生长，所以为实现营造无菌环境和减少研究成本两大目的，需要对植物种类所需糖浓度和有机物数量进行相关研究，选取最合适的环境进行组织培养。

袁丽娜研究发现，卡拉胶比琼脂粉更能促进东北红豆杉愈伤组织的增加，而培养基对于东北红豆杉值体的影响较小。此外，研究發现，半固态的培养基更有利于对东北红豆杉的细胞曾重。解辉在香蕉初代培养采用自然光，半液态培养基，提高了香蕉培养的增殖倍数，利于移栽成活，另外还可用棉籽壳、珍珠岩等代替生根培养基的固化物，不仅能降低成本，减少生根过程中愈伤组织的产生，而且还提高了生根率。

现阶段植物无糖培养逐渐成为植物组织培养的焦点，出现简化组织培养、降低污染的全新方向。无糖组织培养技术克服了常规组织培养过程中普遍的培养容器中气体环境差、易污染等问题。无糖组织培养是利用工程技术手段调控组培微环境的CO2、浓度、光照、湿度等因子，提高组培苗质量，山芋在无糖组织培养培养基中未加入糖，通过人工环境的控制，用二氧化碳代替蔗糖为植物提供碳源，污染率也随之降低 ，添加谷氨酸是促进无糖培养的一条好途径。20世纪80年代后期由日本千叶大学的古在丰树教授研究开发组培新技术，自开发以来备受人们的关注。

3 培养环境

3.1 pH值

植物形态生成及器官发育与pH值的联系不可分割，特别是对培养基的软硬度、盐类是否沉淀及外植体生长发育起到决定性作用。在培养基配制时pH值大多调整在5.3-5.7之间（固体培养基约为5.7；液体培养基约为5.3） 。pH值太高会导致固体培养基过硬而影响实验数据，反之，pH值太低的话又会导致培养基不易凝结，同样不利于实验进行。培养基经高温高压杀菌或长时间的培养均会使pH值降低。降低培养基的pH值，可促进硝酸态氮的利用量，而提高pH值则使钱态氮利用率提高。

3.2 光源

使用适当的光源照射植物，有助于植物的生一长，但在诱导愈伤组织时，大多不照光。适当的光源通常需要考虑光照的强度，光周期及光谱性质。一般实验室以14/10小时的光/暗周期为主。有学者考察一系列光源对植物体的影响，指出蓝光有助于茎顶培养的芽体诱导；红光有助于植物形成不定根。所以蓝光和红光组合使用，或用全太阳光做为植物生长灯成为实验室的普遍选择。这可能和细胞对光反应的生理状态有关。

3.3 光

光在植物的生长发育过程中起到至关重要的作用，主要体现在光照时间的长短会影响百合等植株的休眠状态（主要发生在植株球根的生长和发育阶段）、不同的光环境会影响植株的茎叶紧密度和结实度以及光照程度会影响植株表皮颜色的深浅上。有实验表明，随着光照强度的增加，植物玻璃化现象逐渐加重，光强达到40001ux以上时，组培苗的生长较差。有研究者曾经对兰州百合进行过光照实验，所设置的实验情境为8h黑暗2000LuX16h光照、12h黑暗12h光照两种。研究发现，暗培养环境有助于降低植株的褐化率，光暗交替培养环境褐化率则较高，暗处理下的兰州百合愈伤组织部分呈现为白色或浅黄色，茎叶部分也比光暗交替条件下更为紧密。此外，实验数据还证明，黑暗条件下培养180d后转入光照条件下培养可提高庸香百合愈伤组织诱导率与分化率。但是需要注意的是，在暗培养环境下培养出的植株会出现明显的休眠状况且暗培养环境下不利于不定芽和小鳞茎的叶片的生长。

3.4 温度

温度是影响组织培养的又一个关键性因素，是影响百合鳞茎休眠的最主要因子。实验证明，低温条件下外植物的分化活动变得更为活跃，提高了鳞茎的生理活性，从而有助于促进该植株的生长和发育。此外，高温（28-29℃）培养与丛芽继代方式实现了兰州百合高频温烫处理种球可显著提高‘多安娜及‘普瑞头幼的耐热性。一般实验室对相对湿度容易忽视，导致霉菌及微生物滋生，或造成玻璃质化现象，一般湿度以70%为宜。

3.5 水

水分在植物的生长中发挥着极其重要的作用，植物生长的每一个阶段都离不开水，水分亏缺往往可以加速百合休眠，甚至可以直接引起休眠，所以根据目的不同可以通过水分来调控百合的休眠。除此之外物理作用也会影响百合的生长和分化，微直流可促进多种植物培养组织的生长和分化。一般实验室以14/10小时的光/暗周期为主，湿度高易滋生霉菌及微生物，或造成组培苗质量下降的现象。

4 现阶段开放式组培存在的问题

植物组织培养中最容易出现的是污染问题。在植物组培过程中，组培瓶清洗不干净、培养基灭菌不彻底、接种用具灭菌不严格、超净工作台带菌太多、无菌操作不规范、接种室消毒不严格或后期培养室管理不规范等均会导致污染的发生。实验人员的操作手段也会引起污染，要防止实验人员被微生物感染。

4.1 广谱性抑菌剂的问题

不同的植物在组培过程中产生的污染菌类不同，菌类的种类及抗性又具有很大的复杂性，就现阶段而言还没有找到针对各种污染菌类均有抑制作用的广谱性抑菌剂，已投入使用的部分抑菌剂有次氯酸钠，代森锰锌等。现阶段已有人发现对部分植物具有广谱性杀菌能力的抗菌剂，但是对于大部分植物的抑菌剂仍未报道。

4.2 抑菌剂对组培苗的生长是否有影响

在植物开放组织培养中培养基加入抑菌剂对植株生长是否具有抑制作用仅就目前的实验数据和科学论证而言还没有统一定论。目前仅能确定的是针对某些已经通过实验进行分析的植物所筛选出来的抑菌剂是对植物生长没有影响的，但是继代培养之后的变异情况还需要另行分析或实验研究，尤其是在如今抑菌剂对苗木的抑制作用的机理相关理论尚未突破的情况下。

4.3 开放式组织培养的培养环境问题

迫于技术条件的限制，现阶段的开放式组织培养研究还不十分成熟，培养环境还没有达到自然培养的要求，仅限于在温室内进行培养（只需要进行规范的操作和精确的环境控制即可），存在较大的局限性，迫切需要在形式上和技术上予以突破。但目前，开放组培和光自养微繁殖还处于探索阶段，其中包括广谱抑菌剂的筛选和抑菌剂对组培苗生长影响、培养环境问题。

5 展望

傳统组织培养的重中之重在于无菌，并且需要昂贵的设备，技术要求苛刻，难以广泛应用普及。近些年无数科学家探索简化传统组织培养，但均未获得显著突破。组培污染主要是由于富含营养成分的培养基，给各种菌类提供了适宜的滋生场所。由此，只要将培养基改造成即保证植物组织正常生长，找到一种能够添加到培养基的广谱性杀菌剂使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，具有杀菌、抗菌功能的培养基，进行开放式组织培养是完全可能的。近几年来，已有不少植物组织培养简化成功，并应用于生产。国外已经有100多个以高档花卉、蔬菜为主的植物品种实现了组培产业化。我国仅有香蕉、马铃薯、草幕、兰花等少数实现了组培产业化。

由于一些添加抑菌剂的组培苗会出现褐化，生长较缓慢，增殖倍数较低等影响，这是建立开放式组培难以解决的重要环节。因此，筛选并研究合适的抑菌剂对组培苗生长发育影响生理，从建立具有较高增殖倍数和生根率的高效开放式组织培养体系，成为组培新技术研究的焦点。

有理由相信，开放式组织培养若实现了低配置成本与无菌环境普及两大瓶颈，定会带来巨大的经济价值和广阔市场。因而如何实现其成本减少与无菌环境普及两大难题将是未来较长一段时间内的研究重点、热点和难点，衷心期望植物培养组织技术能真正在农业领域实现普及，从而为现代大农业的发展奠定坚实的技术支持。

参考文献

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作者简介

王凯（1991-），男，陕西省安塞县人。硕士学位。研究方向为生物化学与分子生物学。

张昊（1987-），男，陕西省泾阳县人。硕士学位。研究方向为生物化学与分子生物学。

作者单位

延安大学生命科学学院 陕西省延安市 716000